معايير التحليل الكمي Metalloproteomic عن طريق الحجم استبعاد ICP-MS

حجم استبعاد الكروماتوغرافيا الواصلة مع البلازما المقترنة بالحث - قياس الطيف الكتلي (ICP-MS) هي أداة قوية لقياس التغيرات في وفرة البروتينات المعدنية مباشرة من العينات البيولوجية. نصف هنا مجموعة من معايير البروتين المعدني المستخدمة لتقدير الكتلة الجزيئية وكمية المعدن المرتبطة بالبروتينات غير المعروفة.

الهدف العام لهذه التقنية هو القدرة على تحديد البروتينات المعدنية المختلفة في معايير معقدة بناء على استخدام معايير البروتين المعدني المعروفة. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول دور المعادن في علم الأحياء. على سبيل المثال ، كيف تتغير الحالة المعدنية للبروتين في المرض؟

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح لك بقياس الحالة المعدنية للبروتين في حالته الأصلية. سيظهر هذه التقنية أمبر لوثيان ، طالب دكتوراه من مختبري. للبدء ، الأنسجة المتجانسة ، أو عينات زراعة الخلايا ، عن طريق الهبوط اليدوي أو الصوتنة لمدة خمس دقائق باستخدام محلول ملحي مخزن في Tris.

قم بتوضيح المتجانسات عن طريق الطرد المركزي عند 16 ، 000 مرة G، لمدة خمس دقائق. بعد جمع المادة الطافية الناتجة ، قم بتطبيع الكمية الإجمالية للبروتين عن طريق تحديد تركيزات البروتين كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بتسخين وضبط مطياف البلازما المقترن بالحث ، باستخدام بروتوكولات الشركة المصنعة.

بتخفيف معايير البروتين المعدني للاستمتاع بالسقوط في حدود صفر إلى 500 ميكروغرام لكل لتر ، باستخدام حمض النيتريك بنسبة واحد بالمائة. لتحقيق معايير ضمن هذا النطاق ، لا تستخدم التخفيفات التي تتجاوز واحدا و 20. قم بإعداد ترتيب الحقن عن طريق تحليل مستويات المعايرة السبعة أولا.

تراكيز تتراوح من صفر إلى 500 ميكروغرام لكل لتر ، تليها معايير البروتين المعدني. مستويات المعايرة السبعة هي صفر ، واحد ، خمسة ، عشرة ، 50 ، 100 ، و 500 ميكروغرام لكل لتر. بعد ذلك ، حدد العناصر ذات الأهمية.

هنا ، استخدم الحديد والنحاس والزنك والكوبالت واليود. لأنها العناصر التي تلتزم بها معايير البروتين. حدد العناصر في طريقة الاستحواذ عن طريق فتح علامة تبويب محدد العنصر ، وإضافة العناصر وكتل النظائر الخاصة بها التي سيتم تحليلها.

ثم قم بإجراء تحليل العينة باستخدام الأداة. يقوم برنامج الجهاز تلقائيا بإنشاء منحنيات المعايرة لكل عنصر من العناصر التي يتم تحليلها. استخدم منحنيات المعايرة لتحديد تركيز المعدن في العينات غير المعروفة.

من نتائج التحليل بالجملة ، قم بإنشاء معايير البروتين المعدني التي تشمل العناصر النزرة الثلاثة الأكثر وفرة في أنسجة الثدييات باستخدام مزيج من النحاس وديسموتاز فائق أكسيد الزنك والفيريتين. قم بتطهير الكروماتوغرافيا السريعة عالية الأداء ، أو مضخات HPLC ، باستخدام مخزن مؤقت لنترات الأمونيوم 200 مللي مولار لمدة خمس دقائق بمعدل تدفق يبلغ خمسة ملليلتر في الدقيقة. بمجرد تطهير النظام ، اضبط معدل التدفق عند نقطة الصفر ملليلتر واحد في الدقيقة.

وقم بتوصيل عمود الاستبعاد الجانبي. قم بتوصيل الطرف المقابل للعمود بكاشف الأشعة فوق البنفسجية ، واضبط امتصاص القياس على 280 نانومتر ، باستخدام أنبوب الذروة. قم بزيادة معدل تدفق العمود تدريجيا بزيادات نقطة صفر واحد مليلتر في الدقيقة ، حتى يتم الوصول إلى معدل التدفق النهائي البالغ نقطة صفر وأربعة ملليلتر في الدقيقة.

أثناء حدوث ذلك ، تحقق من وصلات الأنابيب بالعمود بحثا عن أي تسريبات. راقب ضغط هذا النظام للتأكد من أنه لا يتجاوز متطلبات العمود من خلال مراقبة تتبع الضغط على الكروماتوجرام في البرنامج. اترك العمود للتوازن عند معدل التدفق المطلوب عبر خمسة إلى 10 وحدات تخزين أعمدة.

بعد أن يتم موازنته ، قم بتوصيل الأدوات للسماح بإجراء تحليل العينة. قم بإعداد طريقة HPLC لضخ المخزن المؤقت A فوق العمود عند نقطة صفر أربعة ملليلتر في الدقيقة ، لمدة 15 دقيقة. ضع ICPMS في وضع الاستعداد قبل تغيير إعداد الجهاز.

بمجرد الدخول في وضع الاستعداد، قم بإيقاف تشغيل الاتصال الخاص بجهاز أخذ العينات التلقائي، وقم بتغيير مقدمة العينة إلى أخرى. استخدم أنبوب PEEK لتوصيل التدفق الخارج من كاشف الأشعة فوق البنفسجية مباشرة بالبخاخات الموجودة على ICPMS. قم بتشغيل ICPMS ، واترك الجهاز يسخن لمدة 10 إلى 20 دقيقة.

بعد اشتعال البلازما، قم بتوصيل الكبل البعيد من ICPMS بالجزء الخلفي من جهاز أخذ العينات التلقائي HPLC. افعل ذلك بمجرد اشتعال البلازما. خلاف ذلك ، سيتم إيقاف تشغيل نظام HPLC تلقائيا ، نظرا لأن ICPMS غير قيد التشغيل.

قم بتغيير طريقة ICPMS لجمع البيانات ل LC ICPMS عن طريق تغيير طريقة الاستحواذ أولا من الطيف إلى اكتساب الحل الزمني. ثم حدد العناصر المراد تحليلها. الحديد والنحاس والزنك والكوبالت واليود ، بالإضافة إلى أي عناصر أخرى ذات أهمية ، وتحديد أوقات التكامل.

بعد اختيار العناصر ذات الأهمية ، اضبط وقت الاستحواذ ليتناسب مع وقت تشغيل الكروماتوغرافيا. قم بضبط ICPMS يدويا لمعرفة معدلات تدفق غاز الهيليوم للحساسية والتصادم مع عازلة كروماتوغرافيا تتدفق مع السيزيوم والأنتيمون المضمنين في المخزن المؤقت. بمجرد استقرار عدد الأيونات المعدنية ، وتكون قيم الانحراف المعياري النسبي أقل من خمسة بالمائة ، يصبح النظام جاهزا للاستخدام.

قم بإنشاء قوائم تشغيل نموذجية في كل من برامج HPLC و ICPMS. تحتوي قائمة التشغيل النموذجية على الترتيب الذي سيتم به حقن كل عينة. بالإضافة إلى الاسم الذي سيتم حفظ البيانات به.

تحقق من تطابق العدد الإجمالي للعينات في القائمة بين البرنامجين. ابدأ دفعة العينة ل ICPMS قبل HPLC ، حيث سيؤدي حقن العينة بواسطة HPLC إلى تشغيل ICPMS لبدء جمع البيانات. إذا لم يتم ذلك بالترتيب الصحيح ، فسيؤدي ذلك إلى فقدان البيانات.

قم بإنشاء نقاط منحنى المعايرة عن طريق حقن أحجام متفاوتة من معيار ديسموتاز الأكسيد الفائق والفيريتين المختلط. تتراوح أحجام الحقن من ميكرولتر واحد إلى 30 ميكرولتر. أخيرا ، قم بتحليل كل عينة من العينات غير المعروفة ، مثل الأنسجة أو البلازما أو زراعة الخلايا ، قبل تحليل البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص.

يظهر وهم الفيريتين على مدى 2000 إلى 60،000 بيكوغرام من الحديد المحقون على العمود. تم إجراء تحليل الانحدار باستخدام منطقة الذروة. تظهر ملامح الوهم للنحاس والزنك وديسموتاز الفائق لكل من النحاس والزنك.

يتم أيضا عرض تحليلات الانحدار التي تم إنشاؤها باستخدام مناطق الذروة. تستخدم نتائج تحليل الانحدار لتحويل البيانات الأولية بالعدد في الثانية إلى بيكوغرام في الثانية. بحيث يمكن تحديد كمية المعدن المرتبطة بالبروتين كميا.

يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد البروتينات المعدنية في العينات البيولوجية المعقدة. هنا ، يظهر الدماغ البشري مفصولا بواسطة ICPMS SEC. كل منها يمثل معدنا مختلفا محل أهمية.

وهي النحاس أو الزنك أو الحديد. تظهر هنا الآثار التي تم الحصول عليها عندما تتعرض البلازما البشرية لهذه التقنية. سيؤثر تعقيد العينة ووفرة العينة على عدد القمم التي يتم رؤيتها.

كما هو متوقع ، يهيمن عدد قليل من البروتينات المعدنية على البلازما ، بما في ذلك السيرولوبلازمين والترانسفيرين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد أداة ، لقياس الحالة الأصلية للبروتينات المعدنية في العينات المعقدة. بمجرد إتقانها ، يمكن تطبيق هذه التقنية بنجاح في غضون ثلاث إلى أربع ساعات.

هذا يسمح بتحليل 20 إلى 36 عينة في يوم واحد. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم استخدام معايير البروتين المعدني المناسبة، مثل النحاس والزنك SOD إذا كنت مهتما بالنحاس والزنك. بالإضافة إلى المعايير الداخلية في المخزن المؤقت ، مثل السيزيوم ، والتي تسمح لك بتصحيح أي انجراف في الأداة بمرور الوقت.

باتباع هذا الإجراء ، يمكنك أيضا تنفيذ أشكال أخرى من قياس الطيف الكتلي للإجابة على الأسئلة المهمة. مثل ، ما هي البروتينات المعدنية الموجودة في عينتي؟ يمكن القيام بذلك عن طريق الرحلات القياسية في الهضم وتسلسل ببتيد البروتين بالمواصفات الجماعية.

أو ، من خلال تحليل البروتينات بلباقة ، في حالتها الأصلية. بعد تطويرها ، يمكن لهذه التقنية أن تمهد الطريق للباحثين في مجال البروتينات لفهم دور البروتينات المعدنية في الأمراض ، مثل مرض الزهايمر. لا تنس أن العمل مع حمض النيتريك المركز والعينات السريرية.

يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة.