الببتيد والبروتين القياس الكمي باستخدام الآلية المناعية-استخدام (إيمالدي)

الهدف العام من اختبار MALDI المناعي الآلي هذا هو تحديد كمية الببتيدات والبروتينات السليمة في السوائل البيولوجية المعقدة بطريقة دقيقة وحساسة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البروتينات الكمية ، مثل تحديد مستويات البروتين للتشخيص أو لمراقبة استجابة المريض للعلاج. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها يمكن أن تحدد مستويات البروتين بحساسية ودقة شديدة من العينات المعقدة.

تسمح هذه التقنية بتشخيص الأمراض في مرحلة مبكرة لأن خطوة التخصيب المناعي للفحص تسمح بتحديد كمية البروتين المنخفض الوفرة والمؤشرات الحيوية للببتيد. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لنشاط الرينين في البلازما ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الدراسات الأخرى المتعلقة بالأمراض ، مثل القياس الكمي للبروتينات المرتبطة بالسرطان للتشخيص والتشخيص وإدارة العلاج. لبدء هذا الإجراء ، قم بإذابة عينات البلازما البشرية في حمام مائي بدرجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

ثم ضع العينات على الثلج حتى تذوب تماما. بعد ذلك ، قم بنقل 200 ميكرولتر يدويا من كل عينة بلازما لفصل الآبار من صفيحة بئر عميقة 1.1 ملليلتر. الطرد المركزي للوحة لمدة 10 دقائق عند درجتين مئويتين و 3 ، 000 دورة في الدقيقة.

بعد ذلك ، استخدم Bravo لتخفيف محلول قياسي 500 فيمتومول لكل ميكرولتر Ang-1 NAT لتحضير ستة محاليل معايرة مع زلال بياض بيض الدجاج. بعد الطرد المركزي، قم بنقل الماصة 200 ميكرولتر من كل معاير إلى بئر و125 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتوليد إلى لوحة العينة. باستخدام نظام معالجة السوائل الآلي ، امزج 125 ميكرولترا من المادة الطافية في البلازما أو 125 ميكرولترا من محلول ألبومين بياض بيض الدجاج مع 25 ميكرولترا من المخزن المؤقت للأنجيوتنسين من الجيل الأول في طبق بئر جديد بعمق 1.1 مل.

الآن ، قم بنقل المحاليل تلقائيا إلى لوحة 96 بئرا مع ثلاث نسخ مكررة لكل محلول و 34 ميكرولترا من المحلول لكل بئر. ثم احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. لاقتران الجسم المضاد مع حبات البروتين G ، قم أولا بنقل 78 ميكرولترا من ملاط الخرزة المعد مسبقا إلى أنبوب سعة 1.5 مل.

اغسل الخرزات سبع مرات بمليلتر واحد من 25٪ أسيتونيتريل في PBSC وثلاث مرات بمليلتر واحد من PBSC ، باستخدام حامل مغناطيسي لحبيبات الخرز بين كل غسيل. بعد غسل الخرزات ، أعد تعليقها في 110 ميكرولتر من PBSC وأضف 110 ميكرولتر من الجسم المضاد للأنجيوتنسين الأول. امزج الخرز والمحلول عن طريق سحب العينات.

بعد ذلك ، احتضان الخرزات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة أثناء الدوران بسرعة ثمانية دورات في الدقيقة. بعد ذلك ، اغسل الخرزات ثلاث مرات بمليلتر واحد من PBSC. ثم قم بتعليق الخرزات في 1 ، 100 ميكرولتر من PBSC.

الآن ، انقل محلول الخرزة يدويا إلى لوحة 96 بئر. بعد ذلك ، اطلب من Bravo نقل الخرز إلى نفس اللوحة المكونة من 96 بئرا. بعد فترة توليد الأنجيوتنسين الأول التي استمرت ثلاث ساعات ، ضع لوحة الحضانة على الجليد لمدة 10 دقائق لإنهاء توليد الأنجيوتنسين I.قم تلقائيا بتخفيف محلول مخزون الببتيد القياسي المستقر لمعايير النظائر 100 ضعفا مع المخزن المؤقت PBS.

علاوة على ذلك ، قم تلقائيا بنقل تخفيف الببتيد القياسي للنظائر المستقرة إلى لوحة PCR سعة 96 بئرا. انقل 10 ميكرولترات من محلول الببتيد المخفف إلى كل بئر من لوحة الحضانة. اخلطي محلول الببتيد المخفف مع عينات البلازما أو محلول ألبومين بياض بيض الدجاج.

أضف العينة أو المحاليل القياسية تلقائيا إلى محاليل الخرز إلى لوحة الحضانة واخلطها. بعد الحضانة لمدة ساعة واحدة ، اغسل الخرزات تلقائيا ثلاث مرات بمحلول بيكربونات الأمونيوم الخمسة ملليمول. استخدم مغناطيسا لسحب الخرزات إلى الأسفل بعد كل غسلة.

بعد الغسيل الأخير ، أضف 10 ميكرولتر من محلول بيكربونات الأمونيوم إلى كل بئر لإعادة تعليق الخرز. انقل تلقائيا سبعة ميكرولترات من ملاط الخرزة إلى لوحة مستهدفة MALDI بحجم بقعة يبلغ 2،600 ميكرومتر. بمجرد أن تجف الخرزات ، أضف تلقائيا ميكرولترين من محلول مصفوفة HCCA المعد مسبقا من المصفوفة جيدا على كل بقعة عينة على اللوحة المستهدفة.

بعد ذلك ، قم بتحليل بقع العينة باستخدام أداة MALDI-TOF باستخدام وضع العاكس الإيجابي. قم بإجراء المعايرة الداخلية وتنعيم البيانات والطرح الأساسي باستخدام البرنامج الخاص بالمورد. يسمح إجراء iMALDI الآلي لقياس الأنجيوتنسين I بتحليل عالي الإنتاجية لعدد كبير من العينات بمعامل تباين خلال اليوم أقل من 10٪ يتم عرض الأطياف التمثيلية التي تم الحصول عليها عن طريق قياس الأنجيوتنسين I في عينات البلازما البشرية هنا.

هنا ارتباط قيم PRA من 188 عينة من المرضى تم الحصول عليها باستخدام مقايسة iMALDI الآلي مع قيم PRA التي تم الحصول عليها باستخدام إجراء LC-MS / MS السريري. يبلغ معامل ارتباط الطريقتين 0.98 ، وقد يكون الفرق بين المنحدرات بسبب استخدام معايير داخلية مختلفة أو أجسام مضادة مختلفة. يتم عرض النطاق الخطي للمقايسة ودقة الفحص هنا.

بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون خمس ساعات تقريبا. أثناء محاولة هذا الإجراء ، تذكر ضبط رأس الطرف وسرعة معالجة السائل بشكل صحيح. بعد هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق إضافية لتأكيد الألدوستيرونية الأولية لدى المرضى ، بما في ذلك تحميل الملح عن طريق الفم أو اختبارات التسريب الملحي.

تسمح تقنية iMALDI الآلية بالفحص الكمي المحدد والدقيق للعينات البيولوجية ، بما في ذلك عينات المرضى ، بحثا عن البروتينات أو الببتيدات المرتبطة بالأمراض. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء اختبار iMALDI الآلي للبروتين القائم على قياس الطيف الكتلي والقياس الكمي للببتيد. لا تنس أن العمل مع العينات البيولوجية ، مثل البلازما البشرية ، أمر خطير للغاية ، ويجب دائما اتخاذ احتياطات السلامة اللازمة أثناء تنفيذ الإجراء.