سريع سرعة عالية الإنتاجية الأنواع النباتية تحديد المواد عن طريق تحليل المباشر في الوقت الحقيقي عالية الدقة قياس الطيف الكتلي

يتمثل الهدف العام من هذه التجربة في تحديد أنواع المواد النباتية باستخدام مطيافية الكتلة بالتأين المحيط، وذلك بالتزامن مع التحليل الإحصائي متعدد المتغيرات. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجالي الكيمياء والأحياء، مثل تحديد نوع النبات بناءً على بصمته الكيميائية، على سبيل المثال.

ويمكنك أيضاً الحصول على معلومات حول الجزيئات النشطة بيولوجياً الموجودة في أنسجة النبات. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تتطلب قدراً ضئيلاً جداً من تحضير العينات من أجل التحليل، كما يمكن الحصول على البيانات في غضون بضع دقائق. ويمكن استخدام هذه الطريقة أيضاً لحل مشكلات أخرى في الكيمياء.

على سبيل المثال، تتبع الوسائط الناتجة عن التفاعلات ونواتجها في الاصطناع العضوي، وتحليل المصفوفات المعقدة من أنواع مختلفة، وإجراء تحليل الحيز العلوي (headspace analysis). لتحضير مادة أوراق الكراتوم الطازجة، استخدم خرامة ورق ذات قطر 6 مم لإنشاء قصاصات موحدة من مادة أوراق الكراتوم من نبات M.speciosa. كرر هذه العملية خمس مرات.

لاستخلاص مسحوق الكراتوم، استعمل أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter وقم بتعليق كمية صغيرة من مسحوق كراتوم بالي في 1 milliliter من مزيج مذيب يتكون من الإيثانول والماء بنسبة 1:1. كرر هذه العملية خمس مرات. قم بمعالجة عينات مستخلص مسحوق كراتوم بالي بجهاز السونيكيتور في حمام فوق صوتي لمدة 30 minutes في درجة الحرارة المحيطة.

بعد ذلك، قم بطرد عينات مستخلص مسحوق الكراتوم من صنف Bali مركزياً لمدة دقيقتين عند 750 ×g في درجة حرارة الغرفة. قم بسحب المذيب من المسحوق المتبقي لإجراء التحليلات اللاحقة. ولتحضير بذور الداتورا، اقطع بذرة *D.stramonium* إلى نصفين عبر المستوى المستعرض باستخدام شفرة حلاقة.

كرر هذه العملية باستخدام خمس بذور مختلفة. بعد ضبط معلمات مطياف الكتلة (MS) كما هو موضح في البروتوكول النصي، اضغط على Start Run في برنامج التحكم في مطياف الكتلة لتحليل ورقة الكراتوم. ثبّت بقايا مادة نبات ورقة الكراتوم بين مصدر الأيونات ومدخل مطياف الكتلة باستخدام ملاقط حتى يتم الحصول على طيف.

كرر هذا الإجراء خمس مرات باستخدام عينات منفصلة من المادة النباتية. لمعايرة الطيف باستخدام polyethyline glycol 600 المختصر بـ PEG، اغمر الطرف المغلق لأنبوب شعري لنقطة الانصهار في محلول PEG القياسي. علق الأنبوب الشعري المغطى بين مصدر الأيونات ومدخل مطياف الكتلة.

حدد زر الإيقاف لإنهاء عملية التحليل. اضغط على بدء التشغيل (Start Run) في برنامج التحكم بجهاز مطياف الكتلة لتحليل ورقة الكراتوم المجففة. قم بتعليق كمية صغيرة من مادة الأوراق المجففة بين مصدر الأيونات ومدخل مطياف الكتلة باستخدام ملقط حتى يتم الحصول على طيف.

كرر عملية الاستحواذ خمس مرات مع تحليل مادة نباتية جديدة في كل مرة. عاير الطيف باستخدام PEG كما سبق، ثم اختر زر Stop لإنهاء التشغيل التحليلي. ولتحليل مسحوق الكراتوم، اضغط على Start Run في برنامج التحكم في مطياف الكتلة.

اغمس الطرف المغلق لأنبوب شعري لقياس درجة الانصهار في مسحوق الكراتوم. علّق الأنبوب الشعري المغلف بين مصدر الأيونات ومدخل مطياف الكتلة حتى يتم الحصول على طيف. كرر التحليل خمس مرات باستخدام أنبوب شعري جديد في كل مرة، يتبع ذلك معايرة باستخدام PEG.

لتحليل مستخلص الكراتوم، اغمر طرف أنبوب شعري في المستخلص. قم بتعليق الأنبوب الشعري في حامل العينات 12 الموجود على السكة الخطية لمطياف الكتلة. كرر العملية خمس مرات باستخدام مستخلص مختلف في كل مرة.

اضغط على Start Run في برنامج التحكم في مطياف الكتلة. وباستخدام لوحة التحكم، اختر زر التقدم للأمام لتحريك السكة الخطية عبر تيار الأيونات بمعدل 1 mm/s لجمع الأطياف. قم بمعايرة الطيف باستخدام PEG كما سبق، ثم اضغط على Stop لإنهاء عملية التحليل.

لتحليل بذور داتورا، اضغط على "Start Run" في برنامج التحكم الخاص بمطياف الكتلة. قم بتعليق نصف بذرة داتورا بين مصدر الأيونات ومدخل مطياف الكتلة باستخدام ملقط حتى يتم تجميع الطيف. تأكد من توجيه الجانب المقطوع ليواجه مصدر الأيونات.

كرر هذا الإجراء خمس مرات مع تحليل نصف بذرة جديدة في كل مرة. أكمل التحليل باستخدام معايرة PEG واضغط على Stop لإنهاء عملية التحليل. بعد إجراء معالجة البيانات كما هو موضح في البروتوكول النصي، قم بإجراء تحليل المكونات الرئيسية من خلال الانتقال إلى قسم Classify في برنامج التحليل الطيفي تحت علامة التبويب Setup، وإنشاء فئات لمعالجة البيانات عن طريق تحديد Add Class.

استورد ملفات البيانات النصية عن طريق اختيار Add Files. قم بتعيين ملفات البيانات للفئة المناسبة من النباتات عن طريق اختيار Text Files ثم Set Class for Selected Files. اختر كتل الميزات للتمييز من MS من مجموعة التدريب واضبط نسبة العتبة على 1%، بعد ذلك، اضبط تفاوت الكتلة على 10 واختر Build Vectors from Data Files.

في قسم الحساب (Compute)، قم بإجراء تحليل المكونات الرئيسية عن طريق تحديد مربع "3D PCA Graph" ثم اختر "Calculate". قم بإجراء التحقق المتقاطع بطريقة استبعاد عينة واحدة عن طريق اختيار "Validate". بعد ذلك، قم بإنشاء الخريطة الحرارية للبيانات من خلال الانتقال إلى علامة تبويب "Frequency Plot" في برنامج التحليل الطيفي واختيار "Heat Map".

حدد "Threshold saved data" لضبط عتبة الوفرة عند 1%. قم بتصدير الخريطة الحرارية إلى جدول بيانات عن طريق اختيار "Save Heat Map to Excel". في برنامج الجداول البيانات، احفظ الخريطة الحرارية المصدرة كملف نصي. بعد ذلك، ولإجراء تحليل التجميع الهرمي، قم باستيراد الخريطة الحرارية كملف نصي إلى برنامج Cluster 3.0.

في علامة التبويب Hierarchical لبرنامج Cluster 3.0، وتحت قائمة Genes and Arrays، حدد مربعات الاختيار Cluster وCalculate weights. اضبط قيمة cutoff عند 0.1 والأس (exponent) على واحد. اختر single linkage clustering لإجراء التحليل.

أخيراً، قم بعرض ملف بيانات cdt الناتج في عرض شجرة Java. تظهر هنا أطياف ممثلة لمنتجات الكراتوم في وضع الأيونات الموجبة باستخدام التأين الناعم. وقد تم تحديد المركبات التي سبق عزلها من نبات M.speciosa.

بما في ذلك المؤشرات الحيوية ذات التأثير النفسي Mitragynin و 7-Hydroxy-mitragynine. تظهر هنا أطياف ممثلة لبذور داتورا باستخدام وضع الأيون الموجب للتأين الناعم. تم تحديد المركبات التي عُزلت سابقاً من داتورا، بما في ذلك المؤشرات الحيوية ذات التأثير النفسي Atropine و Scopolamine.

تظهر هنا تمثيلات الخرائط الحرارية لبيانات مطيافية الكتلة. كما يظهر مخطط تحليل المكونات الرئيسية أو PCA لبيانات الكراتوم والداتورا. ويوضح مخطط PCA بشكل جلي أن بيانات الكراتوم وبيانات الداتورا منفصلة تماماً عن بعضها البعض.

كما كشف تحليل PCA أن أصناف الكراتوم الفردية والأنواع المختلفة من الداتورا يمكن تحديدها وتمييزها عن بعضها البعض. تظهر هنا نتائج تحليل العنقودية الهرمية أو HCA لبيانات طيف الكتلة الخاصة بالكراتوم والداتورا. وقد كشفت نتائج HCA عن تمايز في الفئات والأنواع والأصناف استناداً فقط إلى البيانات المستمدة من التحليل المباشر في الوقت الحقيقي باستخدام مطيافية الكتلة عالية الدقة، وهو ما أكد نتائج تحليل PCA.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في أقل من ساعة اعتماداً على عدد العينات المتوفرة لديك إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام التحليل المباشر ومطيافية الكتلة في الوقت الحقيقي لتحليل العينات المعقدة، وكيفية استخدام المعالجة بالتحليل الإحصائي للبيانات للحصول على معلومات عن الأنواع. أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تثبيت العينة في تيار الأيونات لفترة زمنية مناسبة من أجل الحصول على طيف كتلة كامل للعينة.

لقد مكنت هذه التقنية الباحثين في العديد من المجالات، بما في ذلك الأوميكس النباتية، والطب الشرعي، والكيمياء العضوية والتحليلية، من استكشاف تحليل المواد المتطايرة التي تفرزها النباتات، وتحديد البدائل القانونية للعقاقير المخدرة، ومراقبة نواتج التفاعل في الوقت الفعلي.