وتقليد من المكروية ورم: طريقة بسيطة لتوليد بالسكان خلية المخصب والتحقيق بين الخلايا الاتصالات
September 20th, 2016
الهدف العام من نموذج الزراعة المشتركة البسيط في المختبر هو تقليد خصائص البيئة المكروية للورم في الجسم الحي ، وإثراء مجموعات الخلايا الفردية ، والتحقيق في طرق مختلفة من الاتصال بين الخلايا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات السرطان والبيولوجيا الإشعاعية ، وتحديدا فيما يتعلق بالعوامل الكامنة وراء توليد الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان والاستجابات للعوامل العلاجية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتوليد مجموعات خلايا فردية من ثقافة الخلايا المختلطة دون وضع علامات مضان أو فرز الخلايا المسببة للإجهاد.
ابدأ بغسل ثقافة الخلايا ذات الأهمية مرتين بخمسة ملليلتر من PBS. بعد الغسيل الثاني ، افصل الخلايا بمليلتر واحد من التربسين EDTA بدرجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بإخماد التفاعل بتسعة ملليلتر من وسط النمو الكامل ، مع سحب الوسط برفق على سطح القارورة 10 مرات لفصل الخلايا.
بعد العد ، قم بتخفيف الخلايا إلى 2.5 في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل تركيز مليلتر في وسط جديد ، وانقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 ملليلترا. قم بتدوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في وسط نمو طازج مكمل بنسبة 50٪ مصل بقري جنين بمعدل 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الخامسة لكل 70 ميكرولتر من التركيز المتوسط. بعد ذلك ، قم بنقل إدخالات بحجم المسام التجريبي المناسب من عبواتها إلى آبار فردية لطبق متعدد الآبار وقم بتغطية الطبق.
ثم أمسك الطبق بكلتا يديه ، واقلب الطبق برفق حتى تتجه قيعان الإدخال لأعلى. قم بإزالة قاع الطبق. باستخدام ملقط معقم في يد واحدة، أمسك أحد الحشوات في مكانه واستخدم اليد الأخرى لشفط 70 ميكرولترا من الخلايا ببطء في طرف ماصة دقيقة.
ثم قم بتوزيع الخلايا ببطء عبر سطح ما أصبح الآن الجانب العلوي من الإدراج. بعد بذر كل من الإدخالات ، استبدل قاع الطبق بعناية واحتضان الطبق المقلوب عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع الرطوبة لمدة 30 إلى 45 دقيقة. في نهاية الحضانة ، في خزانة السلامة البيولوجية ذات التدفق الصفحي ، قم بإعادة قلب الطبق بعناية بحيث تكون قيعان الإدخالات متجهة الآن لأسفل.
ثم اغمر الجزء السفلي من كل ملحق ببطء وبعناية في ملليلترين من الوسط الكامل الدافئ مسبقا ، ثم ضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة المرطبة. بعد 48 ساعة ، استبدل الوسط الموجود في قاع كل بئر بملليلترين من وسط النمو الطازج. عندما يتم تحديث كل الوسيط ، قم بالبذور 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الخامسة من المجموعة الثانية ذات الأهمية في الجزء العلوي من الإدخالات في مليلتر واحد من الوسط الطازج ، وأعد الطبق إلى الحاضنة.
بعد 24 و 48 و 96 ساعة ، استبدل الوسيط الموجود أعلى كل ملحق بمليلتر واحد من الوسط الكامل الطازج. والوسط في قاع كل بئر مع ملليلترين من الوسط الكامل الطازج. بعد 120 ساعة من الزراعة المشتركة ، انقل إدخالا واحدا في كل مرة إلى أطباق زراعة الخلايا الفردية مقاس 35 ملم التي تحتوي على مليلتر واحد من PBS.
واغسل قيعان وجوانب العلوية من الإدخالات بملليلتر واحد من PBS. لجمع الخلايا المزروعة في الجزء السفلي من الملحق ، ضع الجانب السفلي للإدخالات لأسفل في 200 ميكرولتر من التربسين EDTA بدرجة حرارة الغرفة. بعد دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، أوقف التفاعل ب 800 ميكرولتر من وسط النمو الكامل.
ثم أمسك الملحق بزاوية طفيفة ، وقم بربط المادة الطافية برفق على سطح الخلايا 10 مرات ، وجمع الخلايا في الطبق. عندما يتم تجريد جميع الإدخالات ، أعد تعليق الخلايا بتركيز مرتين في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر من وسط النمو. وأضف 250 ميكرولترا من الخلايا إلى أغطية زجاجية فردية معقمة.
ضع الغطاء في الحاضنة المرطبة لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة ، في خزانة السلامة البيولوجية ذات التدفق الرقائقي ، أضف بعناية ملليلترين من وسط النمو الكامل إلى الطبق واحتضانه عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع الرطوبة لمدة 48 ساعة. ثم اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS.
بعد الغسيل الثالث ، قم بتثبيت الخلايا في 4٪ فورمالديهايد في PBS لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة ، تليها خمس غسلات بمحلول ملحي مخزن في Tris. بعد الغسيل الأخير ، قم باختراق الخلايا باستخدام 0.25٪ Triton X-100 مكملا ب 0.1 سابونين لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بالحضانة في محلول الحجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بتسمية العينات بالجسم المضاد الأساسي ذي الأهمية في حجب المحلول عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة الجسم المضاد غير المرتبط بغسل لمدة ثلاث دقائق في محلول الغسيل ، متبوعا بحضانة درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة في الجسم المضاد الثانوي المناسب في محلول الحظر. في نهاية الحضانة ، اغسل الجسم المضاد الثانوي غير المرتبط كما هو موضح للتو وقم بتركيب الغطاء على شرائح فردية مع وسيط تركيب مضاد للبهتان يحتوي على DAPI. أغلق حواف الغطاء بطلاء أظافر شفاف.
ثم قم بتصوير الخلايا تحت تكبير الزيت بمقدار 63x على مجهر مقلوب مزود بمصدر ضوء خارجي لإثارة التألق. يسمح هذا النظام بزراعة مجموعتين مختلفتين من الخلايا على جانبي الأغشية المسامية لإدخالات زراعة الخلايا لمدة 120 ساعة على الأقل ، مع الحفاظ على نقاء أكبر من 99٪ في مجموعات الخلايا على جانبي الغشاء ، عند استخدام إدخالات تحتوي على مسام 0.4 أو ميكرون واحد. ومع ذلك ، فإن الإدخالات ذات المسام الثلاثة ميكرون كبيرة بما يكفي للسماح للخلايا بالهجرة عبر الغشاء كما لوحظ في هذه التجربة باستخدام خط خلايا سرطان الثدي البشري إيجابي GFP.
تحد إدخالات المسام 0.4 ميكرون أيضا من تكوين تقاطعات الفجوة الوظيفية بين مزارع الخلايا على جانبي الملحق ، مما يحد من الاتصال بالعوامل المفرزة. ومع ذلك ، تسمح الإدخالات ذات المسام الواحدة وثلاثة ميكرون بالاقتران الوظيفي للخلايا من خلال تقاطعات الفجوة كما يتضح من نقل ملصق الفلورسنت عبر الغشاء في هذه المزارع المشتركة. الأهم من ذلك ، يمكن استخدام هذا النظام لتوليد الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان بشكل فعال من الخلايا الليفية البشرية ثنائية الصبغيات الطبيعية بعد زراعتها المشتركة مع خلايا سرطان الثدي ، كما يتضح من انخفاض التعبير عن كافيولين -1 على الخلايا الليفية المزروعة مع خلايا سرطان الثدي البشرية.
أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم تحديد إدخالات بحجم مسام مناسب للسؤال الذي يتم استكشافه. ورؤية مجموعة الخلايا الأولى على الجانب السفلي من الإدخال في وسط يسهل ارتباطها. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل النشاف المناعي أو التألق المناعي في الموقع أو معظم المقايسات الأخرى القائمة على الخلايا للإجابة على أسئلة إضافية حول تغييرات تعبير البروتين أو التغيرات في الغزو والهجرة أو الاختلافات في الاستجابات للعوامل العلاجية.
بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا السرطان وبيولوجيا الإشعاع لاستكشاف العوامل التي تساهم في تطور وتطور البيئة المكروية للورم ، وفي حالتنا لانتشار الآثار الضارة للإشعاع المؤين من الخلايا المستهدفة بالإشعاع إلى خلايا المارة في المنطقة المجاورة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الزراعة المشتركة للخلايا المختلطة ، والحفاظ على الزراعة المشتركة ، وحصاد مجموعات الخلايا المخصبة عالية النقاء من الزراعة المشتركة لمزيد من التحليل. لا تنس أن العمل مع سلالات الخلايا البشرية أو خطوط الخلايا يمكن أن يكون خطيرا وأنه يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة ويجب الالتزام بلوائح السلامة البيولوجية المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة نموذجًا بسيطًا لزراعة الخلايا المختلطة في المختبر مصممًا لتقليد بيئة الورم المكروية (TME). يسهل النموذج إثراء مجموعات الخلايا الفردية ويسمح بالتحقيق في التواصل بين الخلايا في ظل ظروف مختلفة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا السرطان
- علم الأحياء الإشعاعي
- تقنيات زراعة الخلايا
الخلفية
- تلعب بيئة الورم المكروية دورًا حاسمًا في تقدم السرطان.
- فهم التواصل بين الخلايا أمر حيوي للتقدم العلاجي.
- غالبًا ما تتضمن الطرق التقليدية تقنيات تسبب الإجهاد.
- تهدف هذه الدراسة إلى تبسيط عملية دراسة تفاعلات الخلايا.
غرض الدراسة
- لمحاكاة الخصائص الحية لـ TME.
- لإثراء مجموعات الخلايا الفردية من المزارع المختلطة.
- لتحقيق أوضاع التواصل بين الخلايا.
الطرق المستخدمة
- استخدام إدخال غشاء دقيق مسامي منفذ.
- نهج مزارع الخلايا المختلطة.
- فصل الخلايا باستخدام trypsin-EDTA.
- إيقاف التفاعل باستخدام وسط نمو كامل.
النتائج الرئيسية
- توليد ناجح لمجموعات الخلايا الفردية المخصبة.
- تسهيل دراسات التواصل بين الخلايا.
- تقليل التوتر المرتبط بالوسم الفلوري.
- ملاحظات حول سلوك الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان.
الاستنتاجات
- يمكن للنموذج محاكاة TME بشكل فعال.
- يوفر أداة قيّمة لأبحاث السرطان.
- تعزز الطريقة فهم تفاعلات الخلايا في السرطان.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This in vitro tumor microenvironment model enables biopharma R&D teams to study early cancer-stroma interactions without perturbing cell physiology, supporting mechanistic de-risking in target validation. By generating highly enriched cancer-associated fibroblast populations and controlling intercellular communication modes, the method provides quantitative insights into stromal modulation of tumor behavior and therapeutic response. It addresses a critical gap in preclinical models by allowing isolation of viable, functional cell populations for downstream analysis, thereby improving predictive confidence in early discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by elucidating heterotypic signaling between carcinoma cells and stromal precursors.
- Operational Value: Supports biological de-risking through functional validation of stromal targets without fluorescent tagging or cell sorting artifacts.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by identifying stromal mediators that influence cancer cell responses to therapeutic agents.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for compound screening by maintaining physiologically relevant co-culture conditions over extended periods.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled pore-size selection that defines communication modes (secreted factors vs. gap-junction).
- Scalability: Enables platform reuse across multiple cancer-stroma pairings for consistent intercellular communication studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by modeling early TME evolution using human breast carcinoma and normal diploid fibroblasts.
- Operational Value: Provides continuity from discovery to preclinical validation by yielding harvestable, high-purity cell populations for protein expression, migration, and drug response assays.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports advancement criteria by quantifying stromal impact on tumor cell behavior under therapeutic pressure.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for stroma-modulating therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled co-culture of cancer and stromal cells to isolate communication-dependent phenotypes.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via enriched cell populations suitable for immunoblotting, immunofluorescence, and functional assays after 120-hour co-culture.
- Analytics: Generates measurable readouts such as caveolin-1 downregulation in fibroblasts, enabling statistical comparison of stromal activation states.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing stromal cells that reflect in vivo-like activation states for drug response studies.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular platform adaptable to various cancer types and stromal lineages, reducing redundant model development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cancer-stroma signaling.
- Operational Value: Delivers standardization and scalability through defined pore-size parameters and stress-free cell harvesting.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing stromal-mediated resistance or sensitivity early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their modulation by tumor-associated stroma.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile cell culture techniques and microporous membrane handling.
- Depends on access to multi-well dishes, cell culture inserts with defined pore sizes (0.4, 1, 3 μm), and standard incubation equipment.
- Necessitates cross-team standardization of co-culture duration, medium composition, and insert orientation for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending to non-fibroblastic stromal cells or alternative cancer models.
- Limited by the inability to study direct cell migration unless using inserts with pore sizes ≥3 μm, as smaller pores restrict physical cell movement.
