الجمعية وتطبيق "خواتم القص ': رواية غشائي نموذج لالمداري، أحادي الاتجاه والدوري السائل تدفق وإجهاد القص

الهدف العام من هذا النموذج هو إنشاء طريقة بسيطة واقتصادية لمحاكاة تدفق السوائل الدوري في المختبر (In Vitro)، ودراسات إجهاد القص على الخلايا البطانية. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال فسيولوجيا الخلايا البطانية، مثل كيفية تأثير القص الدوري على شكل الخلايا البطانية وبنيتها ووظائفها.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في استخدام جهاز زراعة أنسجة بسيط التجميع، والذي يوفر مساحات سطحية كبيرة نسبياً لتقييم الاستجابات الخلوية. سيقوم السيد Luke White، وهو طالب طب في مختبري، بشرح هذا الإجراء. ابدأ هذا الإجراء باستخدام برنامج عرض تقديمي لإنشاء نموذج بناء لحلقة القص بقطر خارجي يبلغ 150 millimeter وقطر داخلي يبلغ 100 millimeter يوضع في مركز الدائرة ذات الـ 150 millimeter.

اطبع القالب على ورقة بيضاء بحجم A4. أثناء العمل تحت غطاء fume hood مع تهوية كافية وارتداء القفازات، انقل بالماصة 10 millimeter من methylene chloride إلى طبق بتري زجاجي سعة 150 millimeter. ومن الضروري أن يكون الطبق زجاجياً لأن methylene chloride يذيب معظم أنواع البلاستيك.

قم بمحاذاة طبق بتري بلاستيكي بقطر 150 millimeter فوق قالب القص الخارجي. استخدم أداة دوارة لحفر ثقب بقطر 3 millimeter في مركز طبق بقطر 100 millimeter. قم بإزالة أي رايش بلاستيكي ناتج عن عملية الحفر.

أثناء الإمساك بطبق بتري قياس 100 millimeter بيد ترتدي قفازاً، اقلب الطبق واغمس حافته العلوية في تجمع من methylene chloride لمدة ثلاث ثوانٍ تقريباً. اترك methylene chloride الزائد يقطر من طبق الـ 100 millimeter، ثم انقل حافة الطبق المبللة بسرعة لتوضع على مركز طبق الـ 150 millimeter. قم بمحاذاة طبق الـ 100 millimeter بعناية فوق القالب المحدد.

قم بتدوير الطبق الذي قطره 100 millimeter بلطف في اتجاه عقارب الساعة وعكس اتجاه عقارب الساعة عدة مرات لضمان الالتصاق الجيد بالطبق الذي قطره 150 millimeter. بمجرد جفاف methylene chloride، اقلب أطباق Petri الملتصقة حديثاً وافحص نقاط التلامس بعناية. إذا لم يتكون ختم محكم تماماً، قم بحقن 0.5 milliliters من methylene chloride عبر الثقب الذي قطره 3 millimeter باستخدام ماصة نقل.

ارفع الطبق وقم بتدويره برفق للسماح لكلوريد الميثيلين بالوصول إلى الحافة. بعد التأكد من تكوين ختم محكم بين طبقي بتري، قم بسد الفتحة الموجودة في الطبق الذي قطره 100 مليمتر عن طريق وضع خرزة من مانع تسرب مطاط السيليكون بعرض 3 مليمتر. وباستخدام أداة دوارة مزودة برأس قطع مسطح، اقطع الجزء العلوي بطول 3 سنتيمتر من أنبوب زراعة أنسجة من البوليسترين مخروطي الشكل بقطر 15 مليمتر، مع ترك سنتيمتر واحد على الأقل من الأنبوب أسفل الغطاء.

استخدم الجانب المسطح من رأس القطع لصقل حافة الأنبوب المقطوع حتى تصبح ملساء ومسطحة. قم بإزالة أي شظايا بلاستيكية ناتجة عن عملية السن. وباستخدام قلم تحديد، ارسم مخططاً لأنبوب الـ 15 milliliter المقطوع على غطاء الطبق الذي قطره 150 millimeter، على بُعد 0.5 centimeters تقريباً من حافة الطبق.

احفر ثقباً داخل الدائرة المرسومة، مع ترك هامش يتراوح تقريباً بين واحد إلى اثنين مليمتر من حافة الدائرة. ضع الجزء العلوي المقطوع من أنبوب conocole فوق الثقب المحفور. وباستخدام ماصة نقل، ضع ما يقرب من ربع مليلتر، أو 250 µL من ميثيلين كلوريد على الحواف المقطوعة لأنبوب conocole لربط أنبوب conocole بالغطاء الذي يبلغ قطره 150 مليمتر.

أخيرًا، يتم إغلاق غطاء طبق الـ 150 millimeter على طبق الـ 150 millimeter من خلال وضع شريط بسماكة 1 millimeter من مادة السيليكون المطاطية المانعة للتسرب حول الحافة الداخلية لطبق بيتري العلوي. يوضح الشكل التخطيطي حلقة إحكام مجمعة، حيث يمثل اللون الأزرق منطقة الخلايا البطانية المزروعة.

تشير الأسهم الحمراء الخارجية والداخلية إلى الحركة المدارية لحلقة القص والوسط الموجود بداخلها عند وضعها على هزاز مداري. استعد للتعقيم عن طريق نقل 10 ملليلتر تقريبًا من PBS إلى حلقة القص التي تم تشكيلها حديثًا، وذلك عبر منفذ أنبوب conocole سعة 15 ملليلتر. قم بتحريك السائل بشكل دائري لإزالة أي شوائب موجودة داخل حلقة القص.

قم بإزالة محلول PBS باستخدام ماصة باستور وجهاز شفط بالتفريغ. كرر غسل PBS حتى تتم إزالة جميع الرواسب. ولتعقيم حلقة القص، سيتم استخدام مزيج من الشطف بإيثانول 70% والتشعيع بالأشعة فوق البنفسجية UV.

قم بفك الغطاء المزوّد بفتحة تهوية، ثم اسحب بواسطة الماصّة حوالي 10 milliliters من 70%ethanol عبر منفذ الوصول وأعد ربط الغطاء. قم بتدوير وقلب الحلقة المشرشرة عدة مرات لضمان غسل الجزء الداخلي من الحلقة المشرشرة جيداً. تحت غطاء زراعة الأنسجة، قم بشفط الـ 70%ethanol الزائد.

باستخدام زجاجة رش، قم برش منفذ الوصول والغطاء جيداً بـ 70% ethanol. بعد ذلك، ضع حلقة القص والغطاء تحت الأشعة فوق البنفسجية في غطاء زراعة الأنسجة حتى يجفا تماماً. وبمجرد جفاف حلقة القص، أعد ربط الغطاء في مكانه.

تُحفظ حلقات القص المعقمة في درجة حرارة الغرفة حتى يتم استخدامها في زراعة الخلايا. وللتحضير لدراسة إجهاد القص، يتم أولاً زراعة الخلايا البطانية في حلقات القص المعقمة وفقاً لبروتوكول زراعة الخلايا القياسي. وتُترك المزرعة حتى تصل إلى مرحلة التلاقي قبل البدء في دراسات التدفق.

عندما تصل الخلايا إلى مرحلة التلاقي، ضع حلقات القص التجريبية على هزاز مداري مُوضع في الرف السفلي داخل الحاضنة لتقليل إجهاد الرف والاهتزاز. ضع حلقات القص الخاصة بمجموعة الضبط الساكنة داخل الحاضنة نفسها. اترك حلقات القص على الهزاز للمدة المطلوبة لتطبيق إجهاد القص.

بعد تعريض طبقات الخلايا لقوى القص للمدة الزمنية المطلوبة، قم بإزالة حلقات القص من الحاضنة. انزع غطاء حلقة القص واستخرج الخلايا و/أو الوسط من أجل تحليل نقطة النهاية المطلوبة. لاحظ أنه بعد فتح حلقات القص، يمكن للباحثين حصاد الخلايا والوسط للتحليل باستخدام عدة طرق.

تظهر هنا نتائج ممثلة لمظهر الطبقات الأحادية من الخلايا البطانية الدماغية البشرية CMEC D3 في حلقات القص بعد 48 ساعة من القص السوائلي الدوري أو التعرض الساكن؛ ولوحظ أن محاذاة المزرعة لا تكون دائمًا موازية لاتجاه التدفق المشار إليه بالأسهم. كما تظهر بعض الاستجابات للقص الدوري في الطبقات الأحادية للخلايا البطانية للأوعية الدقيقة في شبكية الجرذ. أدى التعرض لقص سوائلي دوري لمدة 72 ساعة في حلقات القص إلى انخفاض ملحوظ في جزيء التصاق الصفائح الدموية بالخلايا البطانية مقارنة بضابط تحميل Beta-actin.

بمجرد إتقان هذه العملية، يمكن تصنيع عدة حلقات قص (Shear Rings) في غضون ثلاث ساعات تقريبًا إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة إجراء هذا الإجراء، من المهم تذكر محاذاة الطبق الداخلي بعناية مع الطبق الخارجي، والتأكد من تكوين سدادة محكمة بينهما. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع واستخدام حلقات القص كطريقة بسيطة لإجراء دراسات التدفق المائعي الدوري وإجهاد القص في المختبر (In Vitro) على الخلايا البطانية. ولا تنسَ أن العمل باستخدام كلوريد الميثيلين قد يكون خطيرًا، لذا يجب اتخاذ الاحتياطات دائمًا، مثل العمل تحت غطاء سحب الغازات (fume hood) عند تنفيذ الخطوات التي تتطلب ذلك.