الجمعية وتطبيق "خواتم القص ': رواية غشائي نموذج لالمداري، أحادي الاتجاه والدوري السائل تدفق وإجهاد القص

الهدف العام من هذا النموذج هو إنشاء طريقة بسيطة واقتصادية لتدفق السوائل الدوري في المختبر ، ودراسات إجهاد القص على الخلايا البطانية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال فسيولوجيا الخلايا البطانية. مثل ، كيف يؤثر القص الدوري على شكل الخلية البطانية وهيكلها وأدائها.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم جهاز زراعة الأنسجة الذي تم تجميعه ببساطة ، والذي يوفر مساحات سطحية كبيرة نسبيا لتقييم الاستجابات الخلوية. يوضح هذا الإجراء ، السيد لوك وايت ، طالب الطب في مختبري. ابدأ هذا الإجراء باستخدام إصبع القدم التقديمي لبرنامج العرض التقديمي لإنشاء قالب بناء حلقة القص مع ملف تعريف حافة خارجية 150 ملم وقطر داخلي 100 ملم يوضع في وسط دائرة 150 ملم.

اطبع القالب على ورقة بيضاء مقاس A4. العمل تحت غطاء الدخان مع تهوية كافية وارتداء قفازات ماصة كلوريد الميثيلين 10 ملم في طبق بتري زجاجي 150 ملم. من الأهمية بمكان أن يكون الطبق زجاجيا لأن كلوريد الميثيلين يذوب معظم المواد البلاستيكية.

قم بمحاذاة طبق بتري بلاستيكي مقاس 150 ملم على قالب القص الخارجي. استخدم أداة دوارة لحفر ثقب بطول ثلاثة 3 ملم في وسط طبق 100 ملم. قم بإزالة أي نشارة بلاستيكية ناتجة عن الحفر.

أثناء الإمساك بطبق بتري 100 ملم بيد مرتدية قفاز ، اقلب الحافة العلوية للطبق واغمسها في بركة كلوريد الميثيلين لمدة ثلاث ثوان تقريبا. اسمح لكلوريد الميثيلين الزائد بالتنقيط من الطبق الذي يبلغ طوله 100 ملم ثم انقل حافة الطبق المبلل بسرعة إلى وسط الطبق 150 ملم. قم بمحاذاة الطبق 100 ملم بعناية على القالب المحدد.

قم بتدوير الطبق مقاس 100 ملم برفق في اتجاه عقارب الساعة وعكس اتجاه عقارب الساعة عدة مرات لضمان التصاق جيد بالطبق مقاس 150 ملم. بمجرد أن يجف كلوريد الميثيلين ، اقلب أطباق بتري المربوطة حديثا وافحص نقاط الاتصال بعناية. إذا لم يتشكل ختم محكم بالكامل ، فقم بحقن 0.5 مل من كلوريد الميثيلين من خلال الفتحة 3 ملم بماصة نقل.

التقط الطبق وقم بتدويره برفق للسماح لكلوريد الميثيلين بالوصول إلى الحافة. بعد التأكد من تشكيل ختم محكم بين طبقي بتري ، أغلق الفتحة الموجودة في طبق 100 ملم عن طريق وضع حبة 3 ملم من مادة مانعة للتسرب من مطاط السيليكون. باستخدام أداة دوارة مزودة برأس قطع مسطح ، قم بقطع الجزء العلوي البالغ 3 سم من أنبوب زراعة أنسجة البوليسترين المخروط مقاس 15 ملم ، مع ترك سنتيمترا واحدا على الأقل من الأنبوب أسفل الغطاء.

استخدم الجانب المسطح من رأس القطع لتلميع حافة الأنبوب المقطوع حتى تصبح ناعمة ومسطحة. قم بإزالة أي نشارة بلاستيكية ناتجة عن الطحن. باستخدام علامة ، قم بتتبع أنبوب الكونكول المقطوع سعة 15 مليلتر على غطاء الطبق 150 ملم على بعد حوالي 0.5 سم من حافة الطبق.

احفر حفرة داخل الدائرة المرسومة ، مع ترك هامش على بعد ملليمتر إلى ملليمتر تقريبا من حافة الدائرة. ضع الجزء العلوي من أنبوب المنظار المقطوع فوق الفتحة المحفورة. باستخدام pitette النقل ، ضع ما يقرب من ربع مليلتر ، أو 250 ميكرولتر من كلوريد الميثيلين على الحواف المقطوعة لأنبوب الحلبة لربط أنبوب الحلبة بغطاء 150 ملم.

أخيرا ، أغلق الغطاء مقاس 150 ملم على الطبق الذي يبلغ طوله 150 ملم عن طريق وضع حبة بسمك ملليمتر واحد من مادة مانعة للتسرب من مطاط السيليكون حول الحافة الداخلية لطبق بتري العلوي. يظهر مخطط لحلقة حرق مجمعة. يمثل اللون الأزرق منطقة الخلايا البطانية المطلية.

السهم الأحمر الخارجي الداخلي إلى الحركة المدارية لحلقة القص والوسائط داخل حلقة القص عند وضعها على شاكر مداري. استعد للتعقيم عن طريق سحب ما يقرب من 10 ملليمترات من PBS في حلقة القص المشكلة حديثا ، من خلال منفذ أنبوب المنظار سعة 15 ملليلترا. قم بالتدوير لإزالة أي حطام داخل حلقة القص.

قم بإزالة PBS باستخدام ماصة باستور وشفاط التفريغ. كرر غسل PBS حتى تتم إزالة كل الحطام. لتعقيم حلقة القص ، سيتم استخدام مزيج من شطف الإيثانول بنسبة 70٪ والأشعة فوق البنفسجية.

قم بفك غطاء التهوية ، وقم بفك الماصة حوالي 10 ملليلتر من الإيثانول بنسبة 70٪ من خلال منفذ الوصول وقم بربط الغطاء مرة أخرى. قم بتدوير حلقة الحرق واقلبها عدة مرات مع التأكد من غسل الجزء الداخلي من حلقة الحرق جيدا. تحت غطاء مزرعة الأنسجة ، استنشق 70٪ من الإيثانول الزائد.

باستخدام زجاجة رذاذ ، قم برش منفذ الوصول والغطاء جيدا بنسبة 70٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، ضع حلقة القص والغطاء تحت الأشعة فوق البنفسجية في غطاء مزرعة الأنسجة حتى يجف تماما. بمجرد أن تجف حلقة القص ، قم بربط الغطاء مرة أخرى.

قم بتخزين حلقات القص المعقمة في درجة حرارة الغرفة حتى يتم استخدامها في طلاء زراعة الخلايا. للتحضير لدراسة إجهاد القص ، قم بعمل الخلايا البطانية الأولى في حلقات قص معقمة باتباع بروتوكول زراعة الخلايا القياسي. اسمح للثقافة بالوصول إلى التقاء قبل بدء دراسات التدفق.

عندما تصل الخلايا إلى التقاء ، ضع حلقات القص التجريبية على شاكر مداري يتم وضعه على الرف السفلي في الحاضنة لتقليل إجهاد الرف والاهتزاز. ضع حلقات القص الثابتة لمجموعة التحكم داخل نفس الحاضنة. اترك حلقات القص على شاكر للمدة المطلوبة لتطبيق إجهاد القص.

بعد تعرض طبقات الخلية للقص للمدة الزمنية المطلوبة ، قم بإزالة حلقات القص من الحاضنة. اسحب غطاء حلقة القص واسترجع الخلايا و / أو الوسائط لتحليل نقطة النهاية المطلوبة. لاحظ أنه بعد فتح حلقات القص ، يمكن للمحققين حصاد الخلايا والوسط للتحليل باستخدام عدة طرق.

تظهر النتائج التمثيلية لظهور CMEC D3 Brain Endothelial الخلية الأحادية في حلقات القص بعد 48 ساعة من قص السوائل الدورية أو التعرض الساكن لوحظ أن محاذاة الثقافة ليست دائما موازية لاتجاه التدفق المشار إليه بواسطة الأسهم. تظهر بعض الاستجابات للقص الدوري في الطبقات الأحادية للخلايا البطانية الشبكية الدقيقة للفئران. أدت 72 ساعة من قص السوائل الدورية في حلقات القص إلى انخفاض كبير في جزيء التصاق الخلايا البطانية الصفائح الدموية بالنسبة للتحكم في تحميل بيتا أكتين.

بمجرد إتقان العديد من حلقات القص ، يمكن إنشاؤها في حوالي ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر محاذاة الطبق الداخلي بعناية مع الطبق الخارجي ، ويتشكل الختم المحكم بينهما. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية بناء واستخدام حلقات القص كطريقة بسيطة لإجراء دراسات تدفق السوائل الدورية في المختبر وإجهاد القص على الخلايا البطانية. لا تنس أن العمل مع كلوريد الميثيلين يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل العمل تحت غطاء الدخان أثناء تنفيذ الخطوات التي تتطلب ذلك.