دراسة العمليات الديناميكية للأجسام نانو الحجم في السائل باستخدام المسح الضوئي نقل المجهر
فبراير 5, 2017
يصف هذا البروتوكول تشغيل حامل العينة تدفق السائل لمسح انتقال المجهر الإلكتروني من AuNPs في الماء، كما تستخدم لمراقبة العمليات الحيوية النانوية.
الهدف العام من الفحص المجهري الإلكتروني لنقل الطور السائل هو مراقبة هياكل وظواهر المواد النانوية في العينات البيولوجية المضمنة بالكامل في طبقة سائلة يصل سمكها إلى عدة ميكرومترات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علوم المواد مثل سلوك المواد النانوية في السائل ودراسة العينات البيولوجية في البيئة السائلة الطبيعية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر معلومات مورفولوجية نانوية حول العينات في السائل.
بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن تحميل حامل العينة والحصول على الصورة ليسا بسيطين كما تم إجراؤه لأول مرة باستخدام المجهر الإلكتروني. لبدء الإجراء ، في غطاء التدفق الصفحي النظيف ، قم بتنظيف شريحة زجاجية مجهرية خفيفة بأنسجة خالية من الألياف والإيثانول النقي. ضع الشريحة على منديل غرف الأبحاث في طبق بتري بغطاء.
لمعالجة رقائق SiN الدقيقة ، باستخدام ملاقط مطلية بالكربون ، أمسك الرقاقة بقوة ولكن بعناية على الجوانب الطويلة ، مع الحفاظ على غشاء SiN متجها لأعلى في جميع الأوقات. باستخدام هذه التقنية ، ضع خمس رقائق دقيقة بدون فاصل وخمس رقائق دقيقة بفاصل 200 نانومتر على الشريحة الزجاجية. أغلق طبق بتري واجلب الرقائق الدقيقة إلى غطاء الدخان.
ضع الرقائق الدقيقة في دورق من الأسيتون من الدرجة HPLC مع وضع جانب الغشاء لأعلى. قم بتدوير الدورق برفق لمدة دقيقتين لإزالة الطبقة الواقية ، مع الحرص على عدم قلب الرقائق الدقيقة. ثم انقل الرقائق الدقيقة بسرعة إلى دورق من الإيثانول النقي.
غطي الدورق بورق الألمنيوم. قم بتدوير الدورق برفق لمدة دقيقتين لإنهاء إزالة الطلاء وإحضاره في طبق بتري مغلق إلى غطاء التدفق الرقائقي. ضع الرقائق الدقيقة على منديل جديد في غرفة الأبحاث ، مع الحرص على عدم قلب الرقائق الدقيقة عند إطلاقها من الملقط.
اترك الرقائق الدقيقة تجف لبضع دقائق. ثم ضع الرقائق الدقيقة على الشريحة الزجاجية في طبق بتري. أغلق طبق بتري وأحضر الرقائق الدقيقة إلى منظف البلازما.
ضع الشريحة الزجاجية والرقائق الدقيقة في منظف البلازما وقم بتشغيل برنامج تنظيف مدته خمس دقائق لإزالة الهيدروكربونات من غشاء SiN. باستخدام مجهر ضوئي ، افحص الرقائق الدقيقة بحثا عن الأغشية الممزقة أو جزيئات الأوساخ. تخلص من الرقائق الدقيقة التالفة أو المتسخة.
في غطاء التدفق الرقائقي ، قم بتثبيت الرقائق الدقيقة في صندوق نقل نظيف بسطح داخلي لزج. ضع قطرة ميكرولتر واحدة من محلول جسيمات الذهب النانوية المائية المستقرة بثلاثة سترات مولار على غشاء SiN لكل رقاقة بدون فاصل ، واترك المحلول يجف. ثم ضع ميكرولتر واحد من الماء منزوع الأيونات على الغشاء لغسل الملح والمواد الخافضة للتوتر السطحي.
بعد 30 ثانية ، استخدم ورق الترشيح لإزالة الماء بعناية والسماح للرقائق الدقيقة بالجفاف. ضع طرف حامل TEM لتدفق السائل تحت مجهر ضوئي مجهر. قم بإزالة غطاء التيتانيوم من طرف الحامل وضعه على ورقة من ورق الألمنيوم.
قم بإعداد مضخة حقنة ميكروفلوئيد مع حقنة زجاجية سعة مليلتر واحد تحتوي على 0.5 مل من الماء من الدرجة HPLC. قم بتوصيل المحقنة بنظام التدفق وابدأ تشغيل المضخة. عندما يتم شطف المياه من خلال النظام ، تحقق من الخطوط بحثا عن التسريبات أو انقباضات التدفق.
عند اكتمال الضخ، قم بإزالة الشطف من حجرة الخلية السائلة وجفف طرف الحامل بورق الترشيح. افحص طرف الحامل بالمجهر الضوئي. جفف الطرف بمنديل غرف الأبحاث وقم بإزالة الغبار أو الألياف باستخدام ملاقط نظيفة مطلية ب PTFE.
افحص غطاء طرف الحامل والحلقة O والبراغي وقم بإزالة الغبار أو الألياف باستخدام ملاقط مطلية ب PTFE. ضع الحلقة O في مجموعات الحاملات. ضع المسمار الأول وقم بتدويره عدة مرات حتى يبقى.
باستخدام ملاقط منحنية نظيفة ، ضع عينة الرقاقة في جيب طرف الحامل بحيث يكون غشاء SiN متجها لأعلى. استخدم المجهر الضوئي مجهر للتحقق من تثبيت الرقاقة بشكل صحيح. ضع قطرة 0.3 ميكرولتر من الماء النقي المصفى على عينة الرقاقة.
تثبيت الرقاقة في مكانها باستخدام الملقط. بعد ذلك ، التقط رقاقة فاصلة مع ملاقط منحنية مقلوبة رأسا على عقب. قم بتدوير الملقط بعناية بحيث يكون غشاء الرقاقة متجها لأسفل.
ضع رقاقة الفاصل على عينة الرقاقة. ضع مادة عاكسة للضوء أسفل طرف الحامل وتحقق من محاذاة الرقاقة الدقيقة تحت المجهر الضوئي المجهري. استخدم الملقط لضبط الرقائق الدقيقة بعناية إذا كانت نوافذ SiN غير محاذاة.
ثم التقط غطاء غرفة العينة بالملاقط. اقلب الغطاء رأسا على عقب ، ودون لمس الرقائق الدقيقة ، ضع الجانب الخلفي من الغطاء على طرف الحامل. ضع المسمار المتبقي باستخدام الملقط وشد كلا المسمارين بطريقة متكررة.
شد بعناية حتى تواجه المقاومة. يمكن أن تنكسر النوافذ بسهولة إذا كان الشد قويا جدا. ابدأ تدفق سائل بسعة أربعة ميكرولتر في الدقيقة عبر النظام وتحقق من وجود تسرب في طرف الحامل.
بعد ذلك ، أحضر الحامل إلى محطة ضخ التفريغ وقم بإجراء فحص التسرب. تأكد من أن الضغط يصل إلى 10 على الأقل إلى سالب الخامس ملي بار في غضون خمس دقائق. ضع الحامل في العلبة.
وإحضار الحامل إلى المجهر الإلكتروني. قم بإعداد المجهر في وضع STEM. قم بقياس الكثافة الحالية لشعاع الإلكترون بطبقة كربونية رقيقة مطلية بجسيمات نانوية ذهبية كعينة مرجعية بدون ماء.
ابدأ تدفق المياه النقية بمعدل لا يزيد عن ميكرولتر في الدقيقة. أدخل حامل TEM لتدفق السائل في قفل الحمل الفراغي وابدأ في الإخلاء. تأكد من انخفاض الضغط بشكل طبيعي.
ثم أدخل حامل TEM بالكامل في المجهر. بمجرد أن يصبح الضغط منخفضا بدرجة كافية ، افتح صمام الشعاع وأدخل كاشف ADF. اضبط المجهر على وضع الاستحواذ المستمر وقم بترجمة مرحلة العينة في الاتجاهين X و Y للعثور على نافذة SiN.
اضبط التباين والسطوع بحيث تكون حواف النافذة مرئية بوضوح. قم بترجمة المرحلة في الاتجاهين X و Y بحيث تكون زاوية النافذة في وسط مجال الرؤية. ثم أعد ضبط عدسة الموضوع.
اضبط الوضع الرأسي لمرحلة العينة للتركيز الخشن على الزاوية. قم بإمالة المسرح بمقدار خمس درجات ذهابا وإيابا للتحقق من أن العينة في ارتفاع eucenter. قم بتوسيط زاوية النافذة في مجال الرؤية ثم قم بتخزين موضع المرحلة في البرنامج.
قم بترجمة المرحلة في اتجاهين X و Y حتى تظهر الجسيمات النانوية الذهبية. ثم ركز العدسة الموضوعية. لاحظ الكثافة الحالية واحسب سمك الخلية السائلة.
قم بترجمة المرحلة في الاتجاهين X و Y لتحديد موقع منطقة بها ما لا يقل عن 20 جسيما نانويا من الذهب. قم بتعيين المعلمات والحصول على صورة. الجسيمات النانوية الذهبية التي يتم تجميدها على غشاء نيتريد السيليكون وتصويرها باستخدام الطور السائل STEM.
في الماء النقي ، حافظت الجسيمات النانوية الذهبية على شكلها طوال التصوير. يمكن لمنتجات التحلل الإشعاعي من الماء أن تؤكسد ذرات الذهب الفردية التي يمكن أن تغير في النهاية شكل الجسيمات النانوية. في تجربة أخرى، أدخلنا أيونات الكلوريد في الطور السائل.
ذوبت جزيئات الذهب النانوية ببطء خلال التجربة حيث شكلت ذرات الذهب المؤكسدة رباعي كلورو اللورات القابل للذوبان. للتحقيق في حركات الجسيمات النانوية للذهب في الماء ، في التجربة اللاحقة ، لم يتم تثبيت الجسيمات النانوية بالكامل على غشاء العينة. تكتلت الجسيمات النانوية الذهبية وعند وصولها إلى حجم عنقود حرج ، انتقلت خارج مجال الرؤية.
بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. ستكون هناك حاجة إلى عدة أسابيع من التدريب. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر العمل بهدوء والتحقق من إحكام الفراغ وسمك السائل.
بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في علوم المواد والكيمياء وعلم الأحياء لاستكشاف نمو الجسيمات النانوية وحركتها في السائل ، وبنية المواد النانوية في البيئات السائلة ، ووظائف البروتينات في خلايا الثدييات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء الفحص المجهري الإلكتروني لنقل المسح للجسيمات النانوية الذهبية المضمنة في طبقة الماء بما في ذلك التحميل الصحيح لحامل العينة وتعديل المجهر. لا تنس أن العمل مع السائل في المجهر الإلكتروني يمكن أن يتسبب في تلف إذا لم يتم تحميل حامل العينة بشكل صحيح.
لذلك من المهم التحقق من تسرب الفراغ قبل التحميل.
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول تشغيل حامل عينة تدفق السائل لتصوير نقل الإلكترون الماسح للأنابيب النانوية الذهبية في الماء، مما يسهل ملاحظة العمليات الديناميكية على نطاق النانو.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- تصوير نقل الإلكترون الماسح
- المواد النانوية
- التصوير في الطور السائل
الخلفية
- يسمح تصوير نقل الإلكترون الماسح في الطور السائل بملاحظة المواد النانوية في بيئة سائلة.
- توفر هذه التقنية معلومات مورفولوجية على نطاق النانو عن العينات.
- إنها مفيدة بشكل خاص لدراسة العينات البيولوجية في حالتها السائلة الطبيعية.
- قد يجد المستخدمون الجدد أن تحميل العينة والتقاط الصور أمرًا صعبًا.
غرض الدراسة
- لمراقبة الهياكل والظواهر للمواد النانوية في العينات البيولوجية.
- لدراسة سلوك المواد النانوية في السائل.
- لتعزيز فهم العمليات الديناميكية على نطاق النانو.
الطرق المستخدمة
- تنظيف وتحضير شرائح SiN المصغرة لتحميل العينة.
- تطبيق محلول جسيمات الذهب النانوية على الشرائح المصغرة.
- استخدام حامل TEM لتدفق السائل للتصوير.
- إجراء فحوصات التسرب وضمان المحاذاة الصحيحة للشرائح المصغرة.
النتائج الرئيسية
- يوضح البروتوكول بنجاح تحضير وتصور الأنابيب النانوية الذهبية في بيئة سائلة.
- يحدد الخطوات لضمان سلامة العينة خلال العملية.
- تشير النتائج إلى فعالية حامل تدفق السائل في التقاط العمليات الديناميكية.
الاستنتاجات
- توفر هذه الطريقة رؤى قيمة حول سلوك المواد النانوية في السائل.
- تعزز قدرة مجهر الإلكترون على دراسة العينات البيولوجية.
- قد تتوسع التطبيقات المستقبلية إلى مجالات مختلفة في علم المواد.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Liquid phase scanning transmission electron microscopy enables direct observation of nanomaterial behavior in physiologically relevant liquid environments, supporting target validation through mechanistic de-risking of nanoparticle-biological interactions. This capability enhances predictive confidence in preclinical models by capturing dynamic processes such as agglomeration, dissolution, and cellular uptake under controlled fluid conditions. The method addresses a critical gap in nanomedicine development by providing nanoscale resolution in hydrated states, reducing reliance on inferential assays and improving go/no-go decisions in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by visualizing nanomaterial structural changes in liquid, clarifying mechanisms of action and degradation pathways.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of nanoparticle interactions with biological components in near-native conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying unstable or reactive nanomaterials early, reducing late-stage failure risk due to unforeseen liquid-phase behavior.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by confirming nanomaterial stability and dispersion in liquid media prior to high-content screening.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of particle size, shape, and concentration changes over time, providing reproducible metrics for assay standardization.
- Platform Reuse: Facilitates screening readiness and scalability through standardized microfluidic chip preparation and leak-tight holder assembly, supporting repeated use across compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by maintaining nanomaterials in liquid environments that mimic physiological conditions, improving relevance of efficacy and toxicity readouts.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by quantifying dynamic processes such as ion-induced dissolution or agglomeration, which directly impact bioavailability and safety profiles.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking when primarily mechanistic, clarifying whether observed effects stem from the nanomaterial itself or liquid-phase transformation products.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery through Lead Identification to Preclinical work, supporting hypothesis testing, assay readiness, and translational continuity when nanomaterials are evaluated in liquid environments.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct visualization of nanomaterial behavior in liquid, reducing mechanistic ambiguity in target engagement studies.
- Screening: Describes assay readiness through reproducible liquid cell formation and nanoparticle immobilization, ensuring consistent starting conditions for compound evaluation.
- Analytics: Highlights liquid thickness measurement and nanoparticle tracking as key readouts that help teams compare stability across formulations or environmental conditions.
- Translational Research: Connects method to preclinical continuity by maintaining nanomaterials in hydrated states that reflect in vivo exposure, supporting biomarker alignment when dissolution products or agglomerates correlate with biological response.
- Enterprise Reuse:Frames the method as a reusable capability through standardized microfluidic chip preparation, holder assembly, and leak testing protocols, enabling consistent application across projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in nanomaterial-biological interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of liquid cell preparation and imaging workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by identifying unstable nanomaterials early.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on direct observation of liquid-phase stability and transformation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic handling, vacuum systems, and electron microscopy to ensure proper specimen holder assembly and leak testing.
- Depends on instrumentation including plasma cleaners, liquid flow TEM holders, and STEM-capable microscopes with environmental holders.
- Necessitates cross-team standardization of chip cleaning, spacer use, and flow rate protocols to ensure reproducibility across sites.
- Involves adaptation considerations when transitioning from water-based to complex biological media, including viscosity effects and potential membrane fouling.
- Includes practical limitations such as beam-induced radiolysis effects on liquid chemistry and the need for vacuum compatibility, which may restrict certain volatile or reactive formulations.
