أثار الإجهاد خلية والموت عن طريق التقليدية للأشعة فوق البنفسجية ليزر متحد البؤر المجهر

الهدف العام من نهج استئصال الخلايا هذا هو إجهاد الخلايا الفردية أو قتلها بشكل انتقائي في زراعة الخلايا أو في الحية. تسمح هذه الطريقة للباحثين بدراسة مصير خلية محتضرة واحدة واستجابة الخلايا ، مثل الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية لموقع الاستئصال المحيط. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الاستهداف الدقيق للخلايا الفردية ، ويمكن تحقيق ذلك باستخدام مجهر متحد البؤر منتظم مزود بليزر 405 نانومتر.

نستخدم سمك الزرد كنظام نموذجي لدراسة الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض الخلايا العصبية الحركية أو الخرف الجبهي الصدغي. يوفر تصور موت الخلايا العصبية الحركية والعواقب اللاحقة فرصة ممتازة لفهم العمليات الديناميكية التي ينطوي عليها المرض بشكل أفضل. يسمح نهجنا في إلحاق الإجهاد الخلوي بطريقة تعتمد على الجرعة بالتوصيف التفصيلي للتفاعلات الخلوية.

على سبيل المثال ، إزالة الخلايا الدبقية الصغيرة بعد الموت النورونالي. في حين أن هذه الطريقة توفر نظرة ثاقبة حول آليات مرض الكائن الحي ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا بشكل مشابه في الخلايا المعزولة في الثقافة. بعد إعداد الخطوط المعدلة وراثيا من الذكور والإناث للتزاوج وفقا لبروتوكول النص ، استخدم مصفاة شاي بلاستيكية لجمع الأجنة بعد التفريخ الناجح عن طريق تصفية مياه الخزان.

ثم استخدم ماء البيض لشطف البيض ونقله إلى ماء البيض في طبق بتري. افحص الأجنة تحت المجهر الضوئي لتحديد الإخصاب. ثم احتضان البيض المخضع عند 28 درجة مئوية.

عندما تصل الأجنة إلى يومين إلى خمسة أيام بعد الإخصاب أو DPF ، ضعها تحت مجهر مركب مضان وقم بفحص الأجنة بحثا عن تعبير الفلوروفور المناسب. ثم افصل الأسماك ذات العلامات الزاهية في طبق طازج مع ماء البيض لتضمينها لاحقا. لتضمين سمك الزرد في الاغاروز ، قم بإعداد محلول تخدير عن طريق إضافة أربعة جرامات لكل لتر من MS 222 بالتنقيط إلى طبق بتري يحتوي على ماء البيض.

قم بإعداد مخزون من ماء الأغاروز والبيض منخفض الذوبان وقم بتقطيعه إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل. ضع حصة في كتلة حرارية عند 38 إلى 40 درجة مئوية واتركها تتوازن. لأوقات التصوير التي تزيد عن أربع ساعات ، قم بتقطيع الماصة حوالي 300 ميكرولتر من الاغاروز على طول الدائرة الداخلية لطبق زجاجي القاع لتحضير دائرة على شكل دونات بفتحة صغيرة في المنتصف.

لتركيب سمك الزرد في الاغاروز للفحص المجهري ، بعد تخدير الأسماك وفقا لبروتوكول النص ، استخدم ماصة قابلة للتعديل لسحب يرقة وتركها تغرق في قاع الحافة. أسقط اليرقة في الحد الأدنى من السائل في الاغاروز المسخن مسبقا. ثم ارسم السمك مع الاغاروز وقم بتوزيعه بسرعة في طبق زجاجي معد مسبقا بحجم 35 ملم.

تحت مجهر التشريح ، استخدم فرشاة رسم قياسية لوضع أو متعددة داخل الاغاروز على جوانبها بحيث يكون الجسم والذيل مسطحين. اترك السمكة المغموسة لمدة 10 إلى 15 دقيقة حتى يتماسك الاغاروز بإحكام. ثم استخدم ما يقرب من ملليلترين من ماء البيض مع التريكين لتعبئة طبق بتري 35 ملم بعناية.

ضع طبق بتري مع يرقة مدمجة على مرحلة المجهر متحد البؤر وباستخدام إضاءة المجال الساطع والتكبير 40x ، ركز على الجانب الظهري من الحبل الشوكي للحيوان. قم بالتبديل إلى إعداد التألق المناسب وتصور الهيكل محل الاهتمام للتأكد من أن جميع معلمات التصوير هي حسب الحاجة للاستئصال اللاحق. لتحديد سمك هيكل الاستئصال بالليزر بالأشعة فوق البنفسجية ، استخدم محرك الأقراص Z للتحقق من الجزء العلوي والسفلي من الهيكل محل الاهتمام عن طريق التركيز يدويا لأعلى ولأسفل.

سجل المستوى Z الذي سيتم استئصاله يدويا. على سبيل المثال ، مركز الخلية. لإجراء الاستئصال بالليزر ، ابدأ تشغيل معالج FRAP بالنقر فوق القائمة المنسدلة أعلى قائمة البرامج.

من النافذة الجديدة ، حدد معلمات الصورة لنهج الاستئصال عن طريق تحديد التنسيق وسرعة المسح والمتوسط. إذا لم يتم تحديد المستوى Z للاستئصال بالفعل، فاضغط على الزر Live وركز من خلال العينة حتى يتم التركيز على بنية الفلورسنت أو المستوى Z المطلوب استئصاله في البؤرة. بمجرد تعيين معلمات الصورة العامة ، قم بالوصول إلى خطوة التبييض للتحكم في مكونات الاستئصال المحددة.

ثم قم بتشغيل الليزر 405 نانومتر عن طريق تنشيطه لإجراء التبييض. بعد ذلك ، استخدم خيار Zoom In لزيادة شدة التبييض عند عائد الاستثمار المحدد عن طريق تقليل مجال المسح ، وبالتالي زيادة وقت السكون إلى أقصى حد. حدد عائد استثمار واحد أو أكثر للاستبعاد باستخدام أي من أدوات الرسم في نافذة الحصول على الصور.

استهدف التل المحوري ، على سبيل المثال ، باستخدام أداة الرسم الدائري التي تتراوح من أربعة إلى ثمانية ميكرومترات تقريبا. بعد إنشاء عائد الاستثمار، حدد الزر Time Course وقم بتأكيد عدد الدورات التي سيتم مسح عائد الاستثمار فيها وإلغاء استبعادها. اختر إطارات ما قبل التبييض وما بعد التبييض حسب الرغبة للسماح بإلقاء نظرة عامة على الصورة بأكملها قبل عملية التبييض وبعدها مباشرة.

تسمح هذه الإعدادات للباحثين بطبقات متعددة من الصقل. من خلال ضبط طاقة الليزر ، وسرعة المسح ، ومتوسط الخط ، وحجم منطقة الاهتمام ، والتكرار ، توفر هذه التقنية درجة عالية من الحرية في التسبب في الإجهاد أو الموت في الخلايا الفردية. بعد إنشاء جميع معلمات الاستئصال الضرورية ، اضغط على تشغيل التجربة وراقب كفاءة الاستئصال.

راجع بروتوكول النص للحصول على تفاصيل إضافية. في هذه التجربة ، تم إجراء الاستئصال بالليزر بالأشعة فوق البنفسجية على GFP للتعبير عن الخلايا العصبية الحركية في الحبل الشوكي لأسماك الزرد المعدلة وراثيا. يسمح تعبير GFP المدفوع بمحفزات الخلايا العصبية الحركية مثل 3 MINX one أو IO one أو MET بتصور عالي الدقة لأجسام الخلايا والمحاور الرئيسية والفروع الطرفية الممتدة إلى العضلات.

تحقيق استئصال ناجح للخلايا العصبية في الحبل الشوكي عندما يتلاشى التألق مباشرة بعد الاستئصال ولا يستأنف أبدا. تم تأكيد خصوصية هذا النهج كما هو موضح هنا ، حيث تم تحويل خلية عصبية مستهدفة واحدة باستخدام Photofluro Kaede القابل للتحويل الضوئي الذي يحول انبعاثها من الأخضر إلى الأحمر بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية. لاستهداف الخلايا ذات الشدة المختلفة ، تتوفر طبقات متعددة من الضبط الدقيق عن طريق ضبط طاقة الليزر ، وسرعة المسح ، ومتوسط الخط ، وحجم عائد الاستثمار المراد استئصاله ، والتكرار.

كما هو موضح هنا ، كشفت الخلايا العصبية الحركية ذات الإسقاطات المحورية الطويلة التي تم استئصالها في سوما مع شدة ليزر الأشعة فوق البنفسجية المنخفضة عن النفقات المميزة التي استمرت من سوما على طول المحور العصبي بمرور الوقت. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن كل إعداد متحد البؤر فريد من نوعه ، وأن خرج طاقة الليزر لكل أداة محدد وقد يختلف. بعد الإجراء ، يمكن رؤية السمات المميزة لموت الخلايا المبرمجة في الخلايا العصبية المستعصية.

يمكن اكتشاف علامات موت الخلايا المبرمج مثل XN 5 أو التغيرات المورفولوجية مثل التنكس الجسدي أو الجرس الخارجي بشكل متكرر. يمكن إجراء اختبارات إضافية للإجابة على أسئلة أخرى مثل كيفية تأثر أداء السباحة باستئصال الخلايا العصبية المفردة أو المتعددة في الحبل الشوكي. من خلال عبور خطوط مختلفة من أسماك الزرد المعدلة وراثيا ، يمكن للباحثين التحقيق في استجابة الخلايا الأخرى لتدمير الخلايا الناجم عن الليزر.

توفر هذه الطرق منصة تجريبية فريدة لفهم الآليات الجزيئية الدقيقة لمرض مثل MND في الجسم الحي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير سمك الزرد للفحص المجهري متحد البؤر وكيفية إجراء الاستئصال بالليزر بالأشعة فوق البنفسجية أحادية الخلية.