وبسيطة خطوة واحدة بروتوكول تشريح لجبل لالجامع إعداد الكبار ذبابة الفاكهة أدمغة

الهدف العام من هذا البروتوكول هو وصف إجراء تشريح بسيط من خطوة واحدة لأدمغة ذبابة الفاكهة البالغة ، والتي يمكن أن تنتج بسرعة أدمغة ذات مورفولوجيا محفوظة جيدا ومناسبة لتحليل الجبل بالكامل. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة في مجالات علم الأعصاب وعلم الوراثة. يتضمن ذلك رسم خرائط دقيقة لدوائر الدماغ ، ودراسة آثار التلاعب الجيني للخلايا العصبية ، والتوصيف الوظيفي للجينات.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تنطوي على إجراء سهل التعلم. يمكن أن يسهل تشريح دماغ الذبابة البالغة مع مورفولوجيا محفوظة جيدا في أقل من 10 ثوان. يعد عرض الفيديو لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث أن التحكم في الزخم المطلوب عند إطلاق الملقط لتمزيق الهيكل الخارجي المحيط برأس الذبابة يتطلب مهارات وممارسة.

لقد علمنا ذباب الفاكهة الصغير والمزعج الكثير عن المبادئ البيولوجية. قد تساعدنا أيضا في العثور على أسباب وعلاجات الأمراض التي تصيب الإنسان ، مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون. باستخدام مجهر تشريح مضبوطة على تكبير 1.2 X ، قم بتثبيت الذبابة المخدرة واغمرها في محلول التشريح البارد بحيث يكون البطن متجها لأعلى.

حافظ على الملقط بزاوية 160 إلى 170 درجة خاصة بلوحة التشريح ، ثم مارس قوة صغيرة على بطن الذبابة. يجب أن يؤدي ذلك إلى شل حركة الذبابة ، وإجبار الرأس للخلف من 15 إلى 25 درجة ، وتمديد خرطوم لأعلى. بعد هذه المناورة ، يجب أن تظهر منطقة شفافة ناعمة من البشرة أسفل خرطوم.

قم بزيادة التكبير وضبط المستوى البؤري على هذه المنطقة. باستخدام اليد المهيمنة ، خذ زوجا من ملقط التشريح ومارس الضغط لإغلاق الأطراف. ضع الملقط بشكل عمودي على الملقط الذي يقيد الذبابة.

اخترق الأطراف المغلقة للملقط من خلال المنطقة الناعمة الشفافة من بشرة ، مع الحرص على عدم الاختراق بعمق بحيث تلمس الدماغ. ثم بسرعة ، ولكن بثبات ، حرر الملقط ، بحيث تفتح النقاط ، وتمزيق الهيكل الخارجي لرأس الذبابة. استخدم الزخم الناتج عن إطلاق أطراف الملقط لإزالة الهيكل الخارجي ومعظم الرأس والعين والقصبة الهوائية المرتبطة بلطف من أنسجة المخ بحركة واحدة.

يجب أن يكون الدماغ السليم مرئيا الآن. باستخدام الملقط ، قم بإزالة الأنسجة الملحقة المتبقية بعناية ، مثل أنسجة القصبة الهوائية الليفية البيضاء ، مع الحرص على عدم سحب الدماغ أو إتلافه. ضع عينات الدماغ المقطوعة مع الجذوع المرتبطة بها في ما يقرب من ملليلتر واحد من 4٪ بارافورمالدهايد على الجليد لمدة 40 إلى 60 دقيقة.

قم بإزالة بارافورمالدهايد ، ثم اشطف العينات بمليلتر واحد من X PBS عن طريق سحب المحلول لأعلى ولأسفل ثلاث مرات ، مع الحرص على عدم شفط الدماغ. بعد ذلك ، قم بإزالة PBS ثم اغسلها خمس مرات بمليلتر واحد من X PBT لمدة خمس دقائق لكل منها مع التعويذة. أضف الجسم المضاد الأساسي محل الاهتمام عند التخفيف المناسب.

ثم احتضان العينات طوال الليل عند أربع درجات مئوية مع التعويذة. قم بإزالة الجسم المضاد الأساسي واغسل العينات خمس مرات باستخدام مليلتر واحد من X PBT لمدة خمس إلى 10 دقائق لكل غسلة بالتعويذة. أضف الجسم المضاد الثانوي إلى العينات المغسولة في وقت التخفيف والحضانة المناسب.

بعد ذلك ، اغسل العينات ست مرات في ملليلتر واحد من X PBT لمدة 10 دقائق مع التعويذة. هذه الخطوة ضرورية لإزالة أي أجسام مضادة ثانوية غير مرتبطة على وجه التحديد. احتضان العينات في تخفيف واحد إلى 10،000 من ملليغرام واحد لكل مليلتر DAPI في مليلتر واحد من محلول X PBT لمدة 30 إلى 60 دقيقة مع التعويذة.

أخيرا ، اشطف العينات عن طريق إضافة مليلتر واحد من X PBS ثم سحب المحلول لأعلى ولأسفل ثلاث مرات. ضع زلة غطاء على شريحة تثبيت. باستخدام ماصة ذات طرف مقطوع ، انقل الأدمغة في محلول X PBS واحد إلى الغطاء.

بعد ذلك ، باستخدام الملقط ، افصل الأدمغة عن الأجسام. استخدم طرف ماصة رفيع لإزالة السائل حول أنسجة الدماغ. وبعد ذلك ، أضف 20 إلى 40 ميكرولترا من وسط التركيب المضاد للبهتان.

انشر الأدمغة برفق ، مع إزاحة الوسط اللزج إلى الخارج. بدءا من جانب واحد ، قم بخفض غطاء ثان برفق على العينات ، مع الحرص على تقليل ملامسة الدماغ للفقاعات. اترك الزلات تستقر ، ثم قم بإزالة أي سائل زائد من حافة الزلات باستخدام منديل مختبر.

استخدم قطعة صغيرة من الشريط اللاصق لتوصيل زوج الغطاء مؤقتا بشريحة التثبيت. لتصوير العينات ، استخدم مجهر فلوري مركب أو مجهر متحد البؤر. تظهر هذه الصور مناظر أمامية وخلفية لنفس ذبابة الفاكهة البالغة.

تم تصور نوى الخلايا عن طريق تلطيخ DAPI وتم تصنيف الخلايا العصبية باستخدام علامة عصبية عمومية وأجسام مضادة ل ELAV. تم الكشف عن الخلايا العصبية الدوبامين ، أو DA ، عن طريق صبغة الأجسام المضادة المضادة ل TH. شوهدت مستويات مماثلة من الشدة بين جانبي الدماغ لجميع قنوات الصور.

تسمح المناظر المتضخمة للجزء الأمامي والخلفي من الدماغ بفحص مفصل للمجموعات العصبية DA. يمكن رؤية الكتلة الإنسية الأمامية المقترنة في الصور الأمامية ، والمجموعات الإنسية الخلفية المزدوجة والمجموعات الجانبية الخلفية المزدوجة في الجانب الخلفي من الدماغ. كشف القياس الكمي لهذه الخلايا العصبية أن ذباب سلالة w1118 الذكور البالغ من العمر ثلاثة أيام عادة ما يكون لديه 27 خلية عصبية DA في مجموعة PPM في الدماغ كله ، و 16 في مجموعة PPL لكل نصف كرة ، وخمسة في مجموعة PAL لكل نصف الكرة الأرضية.

شوهد ما معدله 97 خلية عصبية DA في كل من مجموعات PAM clusters. 3D أظهرت أيضا أن الخلايا العصبية DA في مجموعة PAM لها أحجام صغيرة نسبيا وتلوين TH أضعف من تلك الموجودة في المجموعات الأخرى ، مثل PAL. على نحو متزايد ، تركز المزيد من الدراسات على أدمغة الذباب البالغة لتشريح المسارات الجزيئية والدوائر العصبية الكامنة وراء وظائف الدماغ العليا ، ونمذجة أمراض الدماغ البشري.

في مثل هذه الدراسات القائمة على الدماغ ، سيكون من الضروري إعداد عينات الدماغ بكفاءة مع مورفولوجيا محفوظة جيدا. قد يكون هذا مهما بشكل خاص في الشاشات المستندة إلى الدماغ على نطاق واسع. خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كافحت من أجل حمل الذباب في الملقط.

بدلا من الملقط ذو الأطراف الحادة التي يستخدمها معظم باحثي ذبابة الفاكهة ، جرب شبنا ملقطا حادا ووجد أنه من الأسهل تشريح الدماغ. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في أقل من 10 ثوان إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. ذات مرة ، قمت بتشريح حوالي 100 دماغ من ستة أنماط وراثية مختلفة لتجربة واحدة في يوم واحد فقط.

في حين أن إجراء التشريح هذا قد يبدو بسيطا ، فمن المهم ممارسته أولا مع الذباب الذي يمكن الاستغناء عنه. قد يكافح المحقق أيضا في وضع الملقط دون تدمير دماغ الذبابة. يمكن استخدام الأدمغة التي تم تشريحها في دراسات أخرى ، مثل الحمض النووي الريبي ، والتهجين في الموقع ، واستخراج عينة البروتين والحمض النووي الريبي من أنسجة المخ.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون قادرا على تشريح أدمغة الذباب مع مورفولوجيا محفوظة جيدا. نتوقع أنه يمكن تطوير التحسينات لجعل هذا الإجراء أبسط وأسرع. يمكن أن يصبح هذا آليا في المستقبل للدراسات واسعة النطاق.

لا تنس أن العمل مع بارافورمالدهيد والملقط الحاد يمكن أن يكون خطيرا. اتخذ الاحتياطات ، مثل ارتداء القفازات ، عند التعامل مع المحاليل المثبتة ، وبمجرد اكتمال التشريح ، قم بتغطية الملقط على الفور قبل وضعه جانبا.