وبسيطة خطوة واحدة بروتوكول تشريح لجبل لالجامع إعداد الكبار

الهدف العام من هذا البروتوكول هو وصف إجراء تشريح بسيط من خطوة واحدة لأدمغة ذباب الفاكهة (Drosophila) البالغ، والذي يمكنه إنتاج أدمغة بسرعة وبمورفولوجيا محفوظة جيداً بحيث تكون مناسبة للتحليل الكامل (whole mount analysis). يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على تساؤلات في مجالات العلوم العصبية وعلم الوراثة، بما في ذلك التخطيط الدقيق للدوائر الدماغية، ودراسة تأثيرات التلاعبات الجينية في العصبونات، والتوصيف الوظيفي للجينات.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تتضمن إجراءً سهل التعلم؛ حيث يمكنها تسهيل عملية تشريح دماغ ذبابة بالغة مع الحفاظ على مورفولوجيا جيدة في أقل من 10 ثوانٍ. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، لأن التحكم في الزخم المطلوب عند تحرير الملقط لتمزيق الهيكل الخارجي المحيط برأس الذبابة يتطلب مهارة وتدريباً.

لقد علمتنا ذباب الفاكهة الصغيرة والمزعجة الكثير عن المبادئ البيولوجية. وقد تساعدنا أيضًا في العثور على أسباب وعلاجات للأمراض البشرية، مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون. باستخدام مجهر تشريحي مضبوط على تكبير 1.2 X، قم بتثبيت ذبابة مخدرة وغمرها في محلول تشريح بارد بحيث يكون البطن متجهًا للأعلى.

أبقِ الملقط بزاوية تتراوح بين 160 إلى 170 درجة بالنسبة لصفيحة التشريح، ثم ابذل قوة بسيطة على بطن الذبابة. سيؤدي ذلك إلى تثبيت الذبابة، ودفع الرأس للخلف بزاوية 15 إلى 25 درجة، ومد الخرطوم للأعلى. بعد هذه المناورة، ستظهر منطقة شفافة ورقيقة من القشيرة أسفل الخرطوم.

قم بزيادة التكبير واضبط المستوى البؤري على هذه المنطقة. باستخدام اليد المسيطرة، أمسك زوجاً من ملاقط التشريح واضغط لإغلاق الطرفين. ضع الملاقط بشكل عمودي على الملاقط التي تثبت الذبابة.

اغرز طرفي الملقط المغلقين عبر المنطقة الشفافة الرقيقة من القشيرة، مع الحرص على عدم التوغل بعمق يؤدي إلى ملامسة الدماغ. ثم، وبسرعة وثبات، حرر الملقط بحيث تفتح أطرافه، مما يؤدي إلى تمزيق الهيكل الخارجي لرأس الذبابة. استخدم قوة الدفع الناتجة عن تحرير طرفي الملقط لإزالة الهيكل الخارجي ومعظم غلاف الرأس المرتبط بالعين والقصبة الهوائية من أنسجة الدماغ بلطف وفي حركة واحدة.

يجب أن يكون الدماغ السليم مرئياً الآن. وباستخدام الملقط، قم بإزالة الأنسجة الملحقة المتبقية بعناية، مثل الأنسجة الليفية البيضاء للقصبة الهوائية، مع الحرص على عدم سحب الدماغ نفسه أو إتلافه. ضع عينات الدماغ المشرحة مع الجذوع المرتبطة بها في حوالي 1 mL من 4%paraformaldehyde على الثلج لمدة تتراوح من 40 إلى 60 دقيقة.

قم بإزالة البارافورمالدهيد، ثم اشطف العينات بـ 1 mL من 1X PBS عن طريق سحب المحلول وإطلاقه بالماصة ثلاث مرات، مع الحرص على عدم شفط الأدمغة. بعد ذلك، قم بإزالة PBS ثم اغسل خمس مرات بـ 1 mL من 1X PBT لمدة 5 دقائق في كل مرة مع استخدام جهاز الهزاز الدوراني (nutation). أضف الجسم المضاد الأولي المطلوب بالتخفيف المناسب.

ثم تُحضن العينات طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C مع التحريك الدوراني. يتم إزالة الأجسام المضادة الأولية وغسل العينات خمس مرات باستخدام 1 mL من محلول 1X PBT لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق لكل غسلة مع التحريك الدوراني. أضف الأجسام المضادة الثانوية إلى العينات المغسولة بالتخفيف ووقت التحضين المناسبين.

بعد ذلك، اغسل العينات ست مرات في 1 mL من محلول 1X PBT لمدة 10 دقائق لكل غسلة مع التحريك الدوراني (nutation). تُعد هذه الخطوة حاسمة لإزالة أي أجسام مضادة ثانوية مرتبطة بشكل غير نوعي. حضن العينات في تخفيف 1:10,000 من DAPI بتركيز 1 mg/mL في 1 mL من محلول 1X PBT لمدة تتراوح من 30 إلى 60 دقيقة مع التحريك الدوراني.

أخيراً، اغسل العينات بإضافة 1 mL من PBS بتركيز 1X، ثم اسحب المحلول واطره باستخدام الماصة ثلاث مرات. ضع شريحة غطاء على شريحة تثبيت. وباستخدام ماصة ذات طرف مقصوص، انقل الأدمغة الموجودة في محلول 1X PBS إلى شريحة الغطاء.

بعد ذلك، وباستخدام الملقط، افصل الأدمغة عن الأجسام. استخدم رأس ماصة دقيق لإزالة السائل المحيط بأنسجة الدماغ. ثم، أضف من 20 إلى 40 µL من وسط تثبيت مضاد للتلاشي (anti-fade mounting medium).

قم ببسط الأدمغة برفق، مع إزاحة الوسط اللزج نحو الخارج. وبدءاً من أحد الجوانب، أنزل غطاءً زجاجياً ثانياً برفق فوق العينات، مع الحرص على تقليل تلامس الأدمغة مع الفقاعات. اترك الأغطية الزجاجية حتى تستقر، ثم قم بإزالة أي سائل زائد من حواف الأغطية باستخدام منديل مختبري.

استخدم قطعة صغيرة من الشريط اللاصق لتثبيت زوج من غطاء الشرائح مؤقتًا على شريحة التحميل. لتصوير العينات، استخدم مجهرًا فلوريًا مركبًا أو مجهرًا بؤريًا (confocal). تُظهر هذه الصور مناظر أمامية وخلفية لنفس حشرة Drosophila البالغة.

تم تصوير نويات الخلايا باستخدام صبغة DAPI، وتم وسم العصبونات باستخدام وسم عصبي شامل وأجسام مضادة لـ ELAV. كما كُشف عن العصبونات الدوبامينية، أو DA، عن طريق صبغة الجسم المضاد لـ TH. وقد لوحظت مستويات كثافة مماثلة بين كلا جانبي الدماغ لجميع قنوات التصوير.

تسمح الصور المكبرة للجزءين الأمامي والخلفي من الدماغ بفحص تفصيلي لعناقيد الخلايا العصبية الدوبامينية (DA). يمكن رؤية العنقود الإنسي الأمامي المزدوج في الصور الأمامية، بينما تظهر العناقيد الإنسية الخلفية المزدوجة والعناقيد الجانبية الخلفية المزدوجة في الجانب الخلفي من الدماغ. وكشف التحديد الكمي لهذه الخلايا العصبية أن ذباب سلالة w1118 الذكري في عمر ثلاثة أيام يحتوي عادةً على 27 خلية عصبية DA في عنقود PPM في الدماغ بأكمله، و16 خلية في عنقود PPL لكل نصف كرة مخية، وخمس خلايا في عنقود PAL لكل نصف كرة مخية.

لوحظ وجود متوسط قدره 97 من عصبونات DA في كل من تجمعات PAM. كما أظهر إعادة البناء ثلاثي الأبعاد لتجمعات PAL وPAM أن عصبونات DA في تجمع PAM ذات أحجام صغيرة نسبياً وصبغة TH أضعف مقارنة بتلك الموجودة في التجمعات الأخرى، مثل PAL. وبشكل متزايد، تركز المزيد من الدراسات على أدمغة الذباب البالغة لتحليل المسارات الجزيئية والدوائر العصبية التي تكمن وراء وظائف الدماغ العليا، ولنمذجة أمراض الدماغ البشري.

في مثل هذه الدراسات القائمة على الدماغ، سيكون من الضروري تحضير عينات الدماغ بكفاءة مع الحفاظ الجيد على المورفولوجيا. وقد يكون هذا الأمر مهماً بشكل خاص في عمليات الفحص واسعة النطاق القائمة على الدماغ. خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنت أعاني للإمساك بالذباب باستخدام الملقط.

بدلاً من استخدام الملاقط ذات الرؤوس المدببة التي يستخدمها معظم الباحثين في دراسات Drosophila، جربت شينا الملاقط ذات النهايات غير المدببة ووجدت أنها تسهل عملية تشريح الأدمغة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في أقل من 10 ثوانٍ إذا تم أداؤها بشكل صحيح. ولقد سبق لي أن شرّحت حوالي 100 دماغ من ستة أنماط جينية مختلفة لتجربة واحدة في يوم واحد فقط.

على الرغم من أن إجراء التشريح هذا قد يبدو بسيطاً، إلا أنه من المهم التدرب عليه أولاً باستخدام ذباب يمكن الاستغناء عنه. وقد يواجه الباحث صعوبة في وضع الملاقط دون تدمير دماغ الذبابة. ويمكن استخدام الأدمغة التي تم تشريحها في دراسات أخرى، مثل RNA، والتهجين الموضعي (in situ hybridization)، واستخلاص عينات البروتين وRNA من نسيج الدماغ.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادراً على تشريح أدمغة الذباب مع الحفاظ على المورفولوجيا بشكل جيد. ونتوقع إمكانية تطوير تحسينات لجعل هذا الإجراء أبسط وأسرع، مما قد يسمح بأتمتته في المستقبل لإجراء دراسات واسعة النطاق.

لا تنسَ أن العمل باستخدام البارافورمالدهيد وملقط التشريح الحاد قد يكون خطيرًا. اتخذ الاحتياطات اللازمة، مثل ارتداء القفازات عند التعامل مع محاليل التثبيت، وبمجرد اكتمال عملية التشريح، قم بتغطية الملقط على الفور قبل وضعه جانبًا.