تطبيق متعدد الألوان فلبوت تقنية لدراسة عالية الدقة مورفولوجيس وحيد الخلية والتفاعلات بين الخلايا لإطلاق في المورفولوجية

عرض مورفولوجيس مختلف الخلايا وإنشاء مجموعة متنوعة من التفاعلات مع جيرانهم. هذا البروتوكول يصف كيف تكشف مورفولوجية الخلايا المفردة والتحقيق التفاعل خلية-خلية باستخدام نظام التعبير Gal4/UAS الراسخة.

الهدف العام من هذه التقنية هو تصور أشكال الخلية المفردة في الأنسجة التشريحية المعقدة ، وبالتالي تبسيط دراسة تفاعل الخلايا الخلوية في ذبابة الفاكهة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بالأشكال المعقدة وتفاعلات الخلايا الخلوية باستخدام ذبابة الفاكهة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تكييفها مع دراسة أشكال الخلية المفردة في أي نسيج وفي أي مرحلة من مراحل النمو.

ستظهر الإجراء أنجا كيزر ، فنية في مختبرنا. تعدل تقنية MCFO تقنية FlpOut القياسية على النحو التالي. يظل المراسلون المختلفون تحت سيطرة الطائرات بدون طيار ، ومع ذلك ، فإن كل مراسل لديه عمود فقري مشترك لمجلد GFP فائق متعدد ، حيث تم إدخال نسخ من علامة الحاتمة.

تسمى البروتينات غير الفلورية الناتجة اسم وحش السباغيتي GFPs ويتم تحديدها بالأجسام المضادة. اعتمادا على عدد عمليات الاستئصال ، يتم التعبير عن مجموعة مختلفة من الحواتم. نظرا لأن مروج HSP نشط قليلا عند 25 درجة مئوية ، فقم بإعداد التقاطعات عند 18 درجة مئوية حيث يكون غير نشط حقا.

ثم انتظر حوالي 20 يوما للحصول على جيل F1. قم بفرز الإناث والذكور F1 في قوارير منفصلة. لصدمتهم بالحرارة ، انقلهم أولا إلى قوارير طعام طازجة عندما يبلغون من العمر ثلاثة إلى أربعة أيام.

يمكن أن يكون الذباب الأصغر سنا حساسا جدا بحيث لا يمكن أن يكون صدمة حرارية. بعد ذلك ، انقل القوارير إلى حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. اغمرها بعمق لضمان حدوث صدمة حرارية متجانسة.

لوضع العلامات المتناثرة على الخلايا الدبقية ، ابدأ بخمس إلى ثماني دقائق من الصدمة الحرارية ثم قم بتحسينها. سيقوم وقت الصدمة الحرارية الأمثل بتسمية الخلايا المستهدفة بشكل ضئيل وتعتمد علاقتها على برنامج تشغيل GAL4 المحدد المستخدم. بعد الصدمة الحرارية ، ضع القوارير أفقيا على المقعد لبضع دقائق لتبريدها.

الآن ، ابدأ في الحفاظ على الذباب عند 25 درجة مئوية في نفس القوارير. بعد يومين ، سيكون تعبير المراسل هو الأمثل ويمكن تشريح الذباب. استعدادا ، ضع ثلاثة آبار اكتئاب عميقة على الجليد.

املأ بئر واحدة بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وواحدة ب PBS وواحدة بوسط زراعة الخلايا S2. بعد ذلك ، قم بتحميل طبق تشريح بطول ثلاثة سنتيمترات مبطن بالسيليكون الأسود مع S2 البارد. قم بإجراء التشريح بالكامل في S2 للحفاظ على صحة الأنسجة. الآن ، قم بتخدير الذباب بثاني أكسيد الكربون.

بعد ذلك ، باستخدام ملقط أو ريشة ، ضع الذباب في الإيثانول البارد بنسبة 70٪ لمدة 30 ثانية تقريبا متبوعا ب PBS بارد لمدة 30 ثانية تقريبا ثم انقله إلى S2 البارد. وبالتالي ، اغسل كل الذباب المراد تشريحه. عادة ما يكون ما يصل إلى 10 ذباب من النمط الجيني الواحد كافيا. الآن ، في غضون 30 دقيقة ، قم بتشريح كل الأدمغة.

أولا ، افصل الرأس عن باقي الجسم وتخلص من الجسم. حافظ على الرأس ممسكا باليد خلال التشريح بأكمله وإلا سيكون من الصعب جدا استعادة قبضته عليه. بعد ذلك ، اسحب عين واحدة عن طريق الإمساك بالأنسجة أسفل شبكية العين مباشرة.

ثم اسحب العين الأخرى وبالتالي كشف الدماغ والأنسجة المحيطة. بعد ذلك ، قم بإزالة جميع أنسجة القصبة الهوائية والبشرة المتبقية حول الدماغ ، حتى تبدو أنسجة المخ نظيفة. يجب إزالة جميع أنسجة القصبة الهوائية للحصول على أفضل نتائج التلوين.

هذا كل ما هو مطلوب لإعداد الدماغ للتثبيت. استمر في تشريح جميع الأدمغة ، مع الحفاظ على الأدمغة المقطعة في S2 الباردة. حاول أن يكون لديك ما يصل إلى 10 أدمغة معدة لكل أنبوب طرد مركزي دقيق للحصول على تلطيخ مثالي. انقل الأدمغة المعزولة باستخدام طرف ماصة P10 إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 200 ميكرولتر بمحلول تثبيتي.

لا تتعامل أبدا مع الأدمغة باستخدام الملقط. احتضان الأنسجة المحمية من الضوء. تجنب شفط الأدمغة أثناء نقل المحلول.

لإزالة المثبت ، استخدم ثلاث غسلات أو أكثر لمدة 15 دقيقة بمحلول الغسيل. ثم قم بسد الأنسجة بمحلول مانع لمدة 30 دقيقة أو أكثر. بعد ذلك ، استبدل محلول الحجب بالأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول الغسيل واحتضان الأدمغة طوال الليل عند أربع درجات مئوية.

لإزالة الأجسام المضادة الأولية ، استخدم ثلاث غسلات لمدة ساعة واحدة في محلول الغسيل. بعد ذلك ، أضف الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور الثانوية في محلول الغسيل واحتضان الأدمغة طوال الليل عند أربع درجات مئوية أو لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة. لغسل الأجسام المضادة غير المرتبطة تماما ، استخدم ثلاث غسلات لمدة ساعة واحدة في محلول الغسيل متبوعة بغسل أطول باستخدام PBS.

ثم قم بتركيب العقول. قم بإعداد زلتين للغطاء باستخدام فاصل متخيل. في الفاصل وعلى زلة الغطاء الإضافية ، ضع 10 ميكرولتر من وسط التركيب باستخدام عامل مضاد للبهتان.

بعد ذلك ، باستخدام ماصة P10 ، انقل الأدمغة إلى زلة الغطاء ، وقم بإيداعها بجوار الوسط مع بعض PBS. لا تدع الأنسجة تجف. الآن ، انقل الأدمغة بعناية إلى وسط التثبيت باستخدام الماصة وأخيرا انقلها إلى الوسط الموجود في الفاصل ورتبها بالملقط.

ثم قم بإزالة البطانة اللاصقة على الفواصل وقم بإرفاق زلة غطاء. قم بتأمين انزلاق الغطاء بضغط بسيط باستخدام الملقط وتابع على الفور التصوير أو قم بتخزين الشرائح عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لتحليلها لاحقا. باستخدام الطرق الموصوفة ، يتم الحفاظ على ثلاثة مراسلين مختلفين من الأغشية الموسومة صامتين بواسطة نهايات النسخ المحاطة بمواقع FRT.

عندما أصيبت بالصدمة الحرارية ، تم التعبير عن إعادة تركيب FLP وإزالة النهائيات بشكل عشوائي ، مما أدى إلى التعبير عن مجموعات مختلفة من المراسلين. بشكل عام ، توفر مجموعات المراسلين المختلفة سبعة ألوان مختلفة ، وبالتالي يمكن تصور أشكال خلية واحدة متعددة ودراستها بشكل فردي. تم اختبار أوقات الصدمة الحرارية المختلفة باستخدام EG-GAL4 و ALG-GAL4.

تم تحليل وضع العلامات على الخلية المفردة في منطقة الفص الهوائي في الدماغ. تم التعبير عن سائق EG-GAL4 في تغليف الخلايا الدبقية التي تغلفها جميعا على سطح الفص الهوائي. وبالمقارنة ، غطت الخلايا الدبقية الشبيهة بالخلايا النجمية التي يستهدفها ALG-GAL4 في الغالب مناطق غير متداخلة من فص الهوائي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسمية الخلايا المفردة في المحلول. من أجل فهم علاقاتهم المعقدة والتشريحية باستخدام ذبابة الفاكهة ومن حيث المبدأ وفي الكائن الحي النموذجي الذي يمكن فيه تطبيق النظام الثنائي GAL4 UIS. أثناء محاولة هذا الإجراء لأول مرة ، من المهم أن تتذكر أولا تحسين وقت الصدمة الحرارية واتباع الخطوات الفردية لبروتوكول التلوين قدر الإمكان من أجل الحصول على أفضل النتائج.