تحديد الجينوم على نطاق توقيت النسخ المتماثل الثدييات بواسطة الحمض النووي قياس المحتوى

الهدف العام من هذا الإجراء هو تعيين برنامج توقيت النسخ المتماثل على مستوى الجينوم للخلية المختارة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة عن الأسئلة الأساسية في حقل النسخ المتماثل. مثل ، كيف يتغير برنامج النسخ المتماثل الجيني في الصحة والمرض.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها طريقة سريعة وبسيطة لرسم خريطة لتوقيت النسخ المتماثل في مختلف الخلايا والظروف. سيكون الرجل الذي يكتب إجراء الفاكس هو دان ليمان ، خبير الفاكس في كلية الطب. يبدأ هذا الإجراء عادة بمرة إلى اثنتين على الأقل في عشرة إلى سادسة خلايا غير متزامنة سريعة النمو.

بالنسبة للخلايا الملتصقة ، قم بشفط وغسل كل طبق بثلاثة ملليلتر من PBS بدون كالسيوم من المغنيسيوم. تخلص من PBS وأضف ملليلتر واحد من Trypsin-EDTA التجاري إلى كل لوحة. احتضان الخلايا لمدة خمس دقائق ، عند 37 درجة مئوية ، حتى تنفصل.

أضف ثلاثة ملليلتر من وسائط الثقافة لتحييد التربسين وجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر أو أنبوب بوليسترين سعة خمسة ملليلتر. حافظ على الخلايا على الجليد. للبدءالإجراء، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

استنشق وغسل الخلايا بملليلتر واحد من PBS البارد. ثم قم بتدوير الخلايا. بعد الغسيل الثاني ، قم بإزالة PBS وإعادة تعليق الخلايا في 250 ميكرولتر من PBS البارد.

أثناء دوامة الأنبوب برفق ، أضف ببطء 800 ميكرولتر من 20 درجة مئوية تحت الصفر ، وإيثانول عالي النقاء بنسبة 100 في المائة. هذا يؤدي إلى تركيز الإيثانول النهائي لدينا من 70 إلى 80 بالمائة. احتضان الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة.

ابدأ هذا الإجراء عن طريق الطرد المركزي للخلايا الثابتة عند 500 × جم لمدة عشر دقائق عند 4 درجات مئوية. استنشق المادة الطافية بعناية واغسل الخلايا مرتين بمليلتر واحد من PBS البارد. تدور لأسفل بعد كل غسلة.

بعد الغسيل الثاني ، قم بشفط المادة الطافية وأعد تعليق كل خلية بخليط PI التالي. مليلتر واحد من PBS يحتوي على خمسة ميكرولتر من عشرة ملليغرام لكل مليلتر من الحمض النووي الريبي ، و 50 ميكرولتر من ملليغرام واحد لكل مليلتر من يوديد البروبيديوم. قم بتصفية العينة من خلال شبكة 35 ميكرومتر في أنبوب بوليسترين سعة 5 مل.

ختم الأنبوب مع البارافيلم. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 30 دقيقة. احتفظ بالعينات في الظلام لأن يوديد البروبيديوم حساس للضوء.

سيتم فرز الخلايا باستخدام جهاز الفاكس. استخدم ليزر 561 نانومتر للتمييز بين الخلايا بناء على شدة يوديد البروبيديوم. للحصول على أفضل النتائج ، استخدم أصغر فوهة موصى بها لحجم الخلية المحدد.

بالنسبة لمعظم الخلايا ، يبلغ حجمه 85 ميكرومتر. استخدم تدفقا ثابتا وبطيئا. عادة ما يصل إلى 300 إلى 500 حدث في الثانية.

باستخدام Gating، قم بتمييز الخلايا الميتة والحطام تحت الخلوي عن طريق تخطيط FCS مقابل SSC. من الخلايا القابلة للحياة ، قم بتمييز المضاعفات عن طريق رسم عرض SSC مقابل ارتفاع SSC ، متبوعا بعرض FFC مقابل مخطط ارتفاع FFC ، وعرض يوديد البروبيديوم مقابل مخطط ارتفاع يوديد البروبيديوم. بالنسبة لخلايا الإشارة القابلة للحياة ، ارسم رسما بيانيا لكثافة منطقة يوديد البروبيديوم ، والذي يمثل محتوى الحمض النووي للخلايا.

فرز الخلايا في الظروف الباردة إلى مرحلتي G1 و S. يجب أن تكون بوابات S واسعة وتتطفل على مرحلتي G1 و G2. بينما يجب أن تكون بوابات G1 ضيقة وبعيدة عن S قدر الإمكان.

بالنسبة لأنواع الخلايا القادمة ، قد يكون من الصعب الحصول على توزيع جيد لدورة الخلية. من الأهمية بمكان أن تأخذ المرحلة G1 بدون خلايا الطور S. قم بإزالة الأنابيب ذات الخلايا التي تم فرزها من جهاز الفاكس.

احتفظ بالأنابيب على الجليد بعد الفرز. بعد فرز الخلايا ، يتم تنقية الحمض النووي لكل عينة باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي التجارية باتباع إرشادات الشركة المصنعة. بعد ذلك ، قم بتجميع الحمض النووي باستخدام جهاز الموجات فوق الصوتية المركز إلى متوسط حجم الذروة المستهدف البالغ 250 زوجا أساسيا.

تحقق من حجم الحمض النووي الهائل عن طريق التكاثر الكهربائي. توزيع الحجم الموصى به هو 200 إلى 700 زوج أساسي مع ذروة عند حوالي 250 زوجا أساسيا. بعد ذلك ، يتم إعداد المكتبة وتسلسلها وتحليلها كما هو موضح في بروتوكول النص.

يتم عرض خريطة وقت النسخ المتماثل للكروموسوم بأكمله من الخلايا الليفية الجنينية للفأر. مع إلقاء نظرة فاحصة على منطقة تبلغ حوالي 50 ميغا قاعدة. تمثل النقاط نسبة S إلى G1 الطبيعية للنوافذ الفردية ، ويمثل الخط الصلب النتائج من المكعب بسلاسة والاستيفاء.

تتوافق القيم المرتفعة من S إلى G1 مع النسخ المتماثل المبكر ، بينما تتوافق القيم المنخفضة مع النسخ المتماثل المتأخر. تشير الأسهم الحمراء إلى أمثلة على الوقت الثابت لمناطق النسخ المتماثل ، وتشير الأسهم الخضراء إلى مناطق الانتقال الزمني. يوضح هذا الشكل قابلية تكرار وقت خرائط النسخ المتماثل بين ثلاث نسخ من الخلايا الليفية الجنينية للفأر ، مقارنة بثلاث نسخ من خلايا الفئران قبل B في نفس منطقة 18 ميجا قاعدة على كروموسوم الفأر الأول.

تشير الأسهم البرتقالية إلى أمثلة على المناطق التفاضلية بين خطوط الخلايا. تؤكد الخريطة الحرارية لارتباطات الرمح بين العينات الست النتائج. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية من مجموعة الخلايا إلى إنشاء الخرائط في أسبوع واحد إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء وقت الخرائط الجينومية للنسخ المتماثل للخلايا النامية.