تحديد الجينوم على نطاق توقيت النسخ المتماثل الثدييات بواسطة الحمض النووي قياس المحتوى

الهدف العام من هذا الإجراء هو رسم خريطة لبرنامج توقيت التضاعف على نطاق الجينوم في خلية مختارة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التضاعف، مثل كيفية تغير برنامج التضاعف الجينومي في حالتي الصحة والمرض.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في كونها طريقة سريعة وبسيطة لرسم خريطة توقيت التضاعف في مختلف الخلايا والظروف. الشخص المسؤول عن كتابة إجراء الـ fax هو Dan Lehmann، وهو خبير في الـ fax في كلية الطب. يبدأ هذا الإجراء عادةً بوجود ما لا يقل عن 1 إلى 2 × 10⁶ من الخلايا غير المتزامنة سريعة النمو.

بالنسبة للخلايا الملتصقة، يتم سحب وغسل كل طبق باستخدام 3 mL من PBS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم. تخلص من PBS وأضف 1 mL من Trypsin-EDTA التجاري إلى كل طبق. حضّن الخلايا لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة 37 °C حتى تنفصل.

أضف ثلاثة مليلترات من وسط الزرع لتحييد التريبسين (Trypsin) واجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر أو أنبوب بولي ستيرين سعة خمسة مليلترات. احتفظ بالخلايا على الثلج. لبدء هذا الإجراء، قم بطرد الخلايا مركزياً عند 300 x G لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية.

اشفط السائل واغسل الخلايا باستخدام 1 mL من PBS البارد. بعد ذلك، قم بإجراء طرد مركزي للخلايا. وبعد الغسلة الثانية، أزل PBS وأعد تعليق الخلايا في 250 µL من PBS البارد.

أثناء رج الأنبوب بلطف باستخدام جهاز المرج (vortex)، أضف ببطء وبشكل قطرة بقطرة 800 microliters من الإيثانول عالي النقاء بتركيز 100% عند درجة حرارة -20 degree Celsius. سيؤدي ذلك إلى وصول تركيز الإيثانول النهائي إلى 70 إلى 80%. ثم يتم تحضين الخلايا على الثلج لمدة 30 minutes.

ابدأ هذا الإجراء بطرد الخلايا المثبتة مركزياً عند 500 x G لمدة عشر دقائق عند درجة حرارة 4 درجة مئوية. اشفط السائل الطافي بعناية واغسل الخلايا مرتين باستخدام 1 مل من PBS البارد. قم بالطرد المركزي بعد كل غسلة.

بعد الغسلة الثانية، يتم سحب السائل الطافي وإعادة تعليق كل خلية باستخدام خليط PI التالي: 1 mL من PBS يحتوي على 5 µL من RNAase بتركيز 10 mg/mL، و50 µL من propidium iodide بتركيز 1 mg/mL. يتم ترشيح العينة عبر مصفاة بمسام 35 µm في أنبوب بولي ستيرين سعة 5 mL.

أغلق الأنبوب باستخدام البارافيلم. يتم التحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 15 إلى 30 دقيقة. تُحفظ العينات في الظلام لأن propidium iodide حساس للضوء.

سيتم فرز الخلايا باستخدام جهاز FACS. استخدم الليزر بطول موجي 561 نانومتر لتمييز الخلايا بناءً على كثافة صبغة propidium iodide. وللحصول على أفضل النتائج، استخدم أصغر فوهة موصى بها لحجم الخلايا المحدد.

بالنسبة لمعظم الخلايا، تبلغ القيمة 85 micrometers. استخدم تدفقاً ثابتاً وبطيئاً. عادة ما يكون ذلك بمعدل يصل إلى 300 إلى 500 حدث في الثانية.

باستخدام عملية التحديد (Gating)، ميز الخلايا الميتة والحطام دون الخلوي عن طريق رسم FCS مقابل SSC. ومن الخلايا الحية، ميز المزدوجات (doublets) عن طريق رسم عرض SSC مقابل ارتفاع SSC، يليه رسم عرض FFC مقابل ارتفاع FFC، ثم رسم عرض propidium iodide مقابل ارتفاع propidium iodide. وبالنسبة للخلايا ذات الإشارة الحية، ارسم مدرجاً تكرارياً لكثافة مساحة propidium iodide، والتي تمثل محتوى DNA للخلايا.

قم بفرز الخلايا في ظروف باردة إلى مرحلتي G1 وS. يجب أن يكون تحديد البوابة (Gating) للمرحلة S واسعاً ويتداخل مع مرحلتي G1 وG2، بينما يجب أن يكون تحديد البوابة للمرحلة G1 ضيقاً وأبعد ما يمكن عن المرحلة S.

بالنسبة لبعض أنواع الخلايا، قد يكون من الصعب الحصول على توزيع جيد لدورة الخلية. ومن الأكثر أهمية عزل طور G1 دون وجود خلايا في طور S. قم بإزالة الأنابيب التي تحتوي على الخلايا المفروزة من جهاز فرز الخلايا (fax machine).

احتفظ بالأنابيب على الثلج بعد عملية الفرز. عقب فرز الخلايا، يتم تنقية الحمض النووي DNA لكل عينة باستخدام طقم تنقية DNA تجاري وفقاً لإرشادات الشركة المصنعة. بعد ذلك، قم بتجزئة الـ DNA باستخدام جهاز سونيكاتور فائق الموجات مركز للوصول إلى متوسط حجم ذروة مستهدف يبلغ 250 base pairs.

تحقق من حجم الحمض النووي DNA المكسر عن طريق الرحلان الكهربائي. توزيع الحجم الموصى به هو من 200 إلى 700 زوج قاعدي مع ذروة عند حوالي 250 زوج قاعدي. بعد ذلك، يتم تحضير المكتبة وتسلسلها وتحليلها كما هو موضح في البروتوكول النصي.

يوضح الشكل خريطة زمن التضاعف للكروموسوم الأول كاملاً من الخلايا الليفية الجنينية للفأر، مع نظرة تفصيلية على منطقة تبلغ حوالي 50 megabases. تمثل النقاط نسبة S إلى G1 المعيرة للنوافذ الفردية، ويمثل الخط المتصل النتائج المستخلصة من الاستيفاء التكعيبي السلس.

تشير قيم S to G1 المرتفعة إلى التكرار المبكر، بينما تشير القيم المنخفضة إلى التكرار المتأخر. تشير الأسهم الحمراء إلى أمثلة على مناطق زمن التكرار الثابت، وتشير الأسهم الخضراء إلى مناطق الانتقال الزمني. يوضح هذا الشكل مدى قابلية تكرار خرائط زمن التكرار بين ثلاث مكررات من الخلايا الليفية الجنينية للفأر، مقارنة بثلاث مكررات من خلايا pre-B للفأر في نفس المنطقة البالغة 18 megabase على الكروموسوم الأول للفأر.

تشير السهام البرتقالية إلى أمثلة على المناطق المتباينة بين الخطوط الخلوية. وتؤكد خريطة حرارية لارتباطات سبيرمان بين العينات الست هذه النتائج. وبمجرد إتقان هذه التقنية، بدءاً من جمع الخلايا وحتى إنشاء الخرائط، يمكن إتمامها في غضون أسبوع واحد إذا نُفذت بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء خرائط جينومية لتوقيت التضاعف للخلايا النامية.