Name: مستحلب T7 الحمض النووي الريبي البلمرة بوساطة مولتيجين نظام التعبير، بمغس (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: تعلم طريقة التعبير المتزامن لجينات متعددة باستخدام نظام بلمرة T7 في Escherichia coli. تُمكّن هذه التقنية الباحثين من دراسة المجمعات البروتينية وبناء المسارات متعددة البروتينات في علم الأحياء الاصطناعي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد دعم هذا العمل من قبل مجلس العلوم الطبيعية والهندسة البحوث في كندا.

<ol><li>Purnick, P. E. M., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+wave+of+synthetic+biology%3A+from+modules+to+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The second wave of synthetic biology: from modules to systems.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).</li>
<li>Bieniossek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+unrestricted+multigene+recombineering+for+multiprotein+complex+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production.</a> Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).</li>
<li>Jochimsen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+phosphonate+operon+gene+products+as+components+of+a+multi-subunit+complex+of+the+carbon-phosphorus+lyase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).</li>
<li>Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+mevalonate+pathway+in+Escherichia+coli+for+production+of+terpenoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids.</a> Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).</li>
<li>Ajikumar, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoprenoid+pathway+optimization+for+Taxol+precursor+overproduction+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli.</a> Science. 330 (6000), 70-74 (2010).</li>
<li>Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precursor-directed+biosynthesis+of+epothilone+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).</li>
<li>Lundgren, B. R., Boddy, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialic+acid+and+N-acyl+sialic+acid+analog+production+by+fermentation+of+metabolically+and+genetically+engineered+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Biomol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli.</a> Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).</li>
<li>Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/303559323_N-Acetylneuraminic_Acid_Production_in_Escherichia_coli_Lacking_N-Acetylglucosamine_Catabolic_Machinery">N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery.</a> Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).</li>
<li>Romier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-expression+of+protein+complexes+in+prokaryotic+and+eukaryotic+hosts%3A+experimental+procedures%2C+database+tracking+and+case+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%2C+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies.</a> Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).</li>
<li>Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+protein+coexpression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Strategies for protein coexpression in Escherichia coli.</a> Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).</li>
<li>Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+ligation-independent+expression+vectors+for+co-expression+of+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).</li>
<li>Kim, K. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-promoter+vector+is+highly+efficient+for+overproduction+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes.</a> Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).</li>
<li>Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pST44+polycistronic+expression+system+for+producing+protein+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).</li>
<li>Chen, X., Pham, E., Truong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEV+protease-facilitated+stoichiometric+delivery+of+multiple+genes+using+a+single+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector.</a> Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), (2012).</li>
<li>Sukumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+determination+of+nucleic+acids+and+proteins+using+the+micro-volume+BioSpec-nano-spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (48), (2011).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning">https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning</a> (2016).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot">https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot</a> (2016).</li>
<li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> J. Vis. Exp. (27), (2009).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

ويعتبر التعبير المشترك عن الجينات المتعددة أمرا ضروريا بشكل متزايد، خاصة في تحديد وإعادة تشكيل مسارات الأيض المعقدة المتعددة الأقطاب 3 و 4 و 5 . نظام بمغس يجعل مولتيجين شارك في التعبير في E. القولونية الروتينية 6 ، 7 ، 8 ويمكن الوصول إليها للباحثين متنوعة. في هذه الدراسة، أظهرت خمسة بروت...

ويعتبر التعبير المشترك عن بروتينات متعددة أمرا ضروريا بشكل متزايد، لا سيما في تطبيقات البيولوجيا التخليقية، حيث يجب التعبير عن وحدات وظيفية متعددة 1 ؛ في دراسة البروتينات المجمعات البروتين، حيث التعبير وظيفة غالبا ما تتطلب تعبير مشترك 2 ، 3 ؛ وفي تحديد وتسخير المسارات الحيوية، حيث يجب التعبير عن كل جين في المسار 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 . وقد تم تطوير عدد من النظم للتعبير المشترك، وخاصة في الكائن المضيف الكولي القولونية ، الحصان العمل للتعبير المختبري البروتين المؤتلف 9 . على سبيل المثال، يمكن استخدام البلازميدات متعددة مع علامات اختيار مختلفة للتعبير عن البروتينات الفردية باستخدام ثروة من مختلف السابقين<html> ناقلات بريسيون 10 ، 11 . وقد استخدمت أنظمة البلازميد واحدة لتعبير البروتين متعددة إما المروجين متعددة للسيطرة على التعبير عن كل جين 10 ، 12 ؛ أوبيرونات الاصطناعية، حيث يتم ترميز العديد من الجينات على نص واحد 2 ، 13 ؛ أو، في بعض الحالات، جين واحد ترميز ببتيد التي تتم معالجتها في نهاية المطاف بروتيوليتيكالي، مما أسفر عن البروتينات المطلوبة من الفائدة 14 . <img alt="شكل 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig1.jpg" /> الشكل 1: بمغكس سير العمل تظهر بناء متجه بوليسيسترونيك. يوفر نظام بمغس استراتيجية مرنة وسهلة الاستخدام لبناء الأوبرونات الاصطناعية تحت سيطرة المروج T7 محرض.e.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg &quot;تارجيت =&quot; _ بلانك &quot;&gt; الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. في هذه المخطوطة، يتم وصف استخدام نظام فعال للغاية لبناء مولدات الجينات الاصطناعية تحت سيطرة T7 الحمض النووي الريبي البلمرة ( الشكل 1 ). هذا النظام يسمح العديد من الجينات ليتم التعبير عنها في وقت واحد من البلازميد واحد. لأنه يقوم على نظام البلازميد، ودعا في الأصل pKH22، التي تم استخدامها بنجاح لعدد من التطبيقات المختلفة 6 ، 7 ، 8 . هنا، يتم توسيع هذه المجموعة البلازميد لتشمل أربعة ناقلات ذات الصلة: بمغس-A، ناقلات التعبير تفتقر إلى أي علامات C- أو N- المحطة ومع علامة مقاومة الأمبيسلين. بمغس-هيسا، ناقلات التعبير ترميز علامة هيكساهستيدين N- محطة ومع علامة مقاومة الأمبيسلين. بمغس-K، ناقلات التعبير lأي علامات C- أو N- محطة ومع علامة مقاومة الكاناميسين. و بمغس-هيسك، ناقلات التعبير ترميز علامة هيكساهستيدين N- محطة ومع علامة المقاومة كانامايسين. في هذه الدراسة، وتظهر طريقة لتوليد ناقلات بوليسيسترونيك التي تحتوي على خمسة الجينات باستخدام نظام بمغكس، تحديدا بمغس-A، جنبا إلى جنب مع الإنتاج الناجح لكل بروتين الفردية في القولونية .

<table><tbody><tr><td><قوي >إنزيمات < / قوي ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>الفوسفاتيز القلوي ، معوي العجل (CIP)</td><td>نيو إنجلاند بيولابز</td><td>M0290S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>نيو إنجلاند بيولابز</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>نيو إنجلاند بيولابس</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>نيو إنجلاند بيولابز</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>جديد إنجلترا Biolabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA Polymerase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600677</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Recodes< / قوي ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 كيلو بايت سلم الحمض النووي</td><td>نيو إنجلاند بيولابس</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>4-20٪ Mini-PROTEAN TGX جل بروتين خال من البقع</td><td>Bio-Rad</td><td>456-8095</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1332-4</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Sigma-Alrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) خلايا</td><td></td><td></td> كومبنت <td>كيميائية خلية Comeptent محضرة في المنزل</td></tr><tr><td>B-PER كاشف استخراج البروتين البكتيري</td><td>فيشر Thermo Scientific</td><td>PI78243</td><td></td></tr><tr><td>dNTP مزيج</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>المزود بمجموعة</td></tr> <tr><td></td><td>استخراج هلام البوليميرازأوميغا</td><td>D2500-02</td><td>E.Z.N.A استخراج جل ، مقدمة من VWR Cat 3: CA101318-972</td></tr><tr><td>جلايسين</td><td>فيشر ثيرمو سيانتيفيك</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>جسمه المضاد العلامة [HRP] ، mAb ، Mouse</td><td>GenScript</td><td>A00612</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td><td>EMD Millipore</td><td>WBKLS0100</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Alrich</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>A411-20</td><td></td></tr> مسحوق <tr><td>الحليب الخالي من الدسم المبستر</td> الفوري متجر <td>البقالة</td><td></td> المحلي <td>حليب البقالة الذي لا يحمل اسما كاف</td></tr><tr><td>غشاء النيتروسليلوز</td><td>Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences)</td> <td>10600007</td><td>غشاء PT 0.45 & micro ؛ م 200 مم × 4 م ، مقدمة من VWR Cat #: CA10061-086</td></tr><tr><td>طقم عزل الحمض النووي البلازميد</td><td>أوميغا</td><td>D6943-02</td><td>E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I ، المقدم من VWR Cat #: CA101318-898</td></tr><tr><td>pMGX</td><td>Boddy Lab</td><td></td><td>طلب من Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca</td></tr><tr><td>Primers Interintegrated</td><td>DNA Technologies تصميم</td><td></td><td>الاشعال حسب الحاجة للجينات المطلوبة</td></tr><tr><td>تقنيات الحياة الجينية الاصطناعية</td><td></td><td></td><td>تصميم وتحسين حسب الحاجة</td></tr><tr><td>ورقة ترشيح لطخة سميكة</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>قاعدة تريس</td><td>BioShop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Alrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue خلايا</td><td></td><td></td> مختصة كيميائيا <td>خلية Comeptent محضرة في المنزل</td></tr> <tr><td><قوي>الاسم< قوي></td><td><قوي> الشركة</td><td> رقم الكتالوج</td><td>تعليقات</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioSpectrometer</td><td>Eppendorf</td><td>RK-83600-07</td><td></td></tr><tr><td>Gel box - PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005</td><td>Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophorese</td></tr><tr><td>خلية جل تصوير</td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>AlphaImager EC</td></tr><tr><td>حاضنة فرن</td><td>فيشر ثيرمو سيانتيفيك</td><td>11-690-650D</td><td>حاضنة متساوية الدرجة</td></tr><tr><td>الأولى شاكر</td><td>فيشر ثيرمو ساينتفيك</td><td>SHKE6000-7</td><td>ماكس كيو 6000 ماكس كيو 6000</td></tr><tr><td>بيرسونا شفرات</td> الحلاقة <td>فيشر ثيرمو ساینتفيك</td><td>S04615</td><td></td></tr><tr><td>حزمة الطاقة</td><td>بيو راد</td><td>S65533Q</td><td>FB300</td></tr><tr><td>Transilluminator</td><td>VWR الدولية</td><td>M-10E ، 6W</td><td></td></tr><tr><td>Thermocylcer</td><td>Eppendorf</td><td>Z316091</td><td>Mastercycler Personal ، مقدمة من Sigma</td></tr><tr><td>UV Face-Shield</td><td></td><td>18-999-4542</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>15-460-2SQ</td><td></td></tr> جهاز <tr><td>النقل الغربي</td><td>Bio-Rad</td><td>1703935</td><td>Mini-Trans Blot Cell</td></tr></tbody></table>

مستحلب t7 الحمض النووي الريبي البلمرة بوساطة مولتيجين نظام التعبير، بمغس

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

ويعتبر التعبير المشترك عن بروتينات متعددة أمرا ضروريا بشكل متزايد للبيولوجيا التركيبية، ودراسة مجمعات البروتينات البروتينية، وتوصيف وتسخير المسارات الحيوية. في هذه المخطوطة، يتم وصف استخدام نظام فعال للغاية لبناء أوبيرونات الاصطناعية مولتيجين تحت سيطرة بوليميراز T7 الحمض النووي الريبي. هذا النظام يسمح العديد من الجينات ليتم التعبير عنها في وقت واحد من البلازميد واحد. هنا، مجموعة من أربعة ناقلات ذات الصلة، بمغس-A، بمغس-هيسا، بمغس-K، و بمغكس-هيسك، مع امبيسلين أو كاناميسين مقاومة اختيار علامة (A و K) وإما امتلاك أو تفتقر إلى N- محطة هيكساهستيدين علامة (له) يتم الكشف عنها. يتم توفير بروتوكولات مفصلة لبناء الأوبرونات الاصطناعية باستخدام هذا النظام المتجه جنبا إلى جنب مع البيانات المقابلة، تبين أن نظام القائم على بمغس تحتوي على خمسة جينات يمكن أن تكون شيدت بسهولة واستخدامها لإنتاج جميع البروتينات المشفرة الخمسة في الإشريكية القولونية . هذا الكيسإم والبروتوكول تمكن الباحثين من التعبير بشكل روتيني عن وحدات معقدة متعددة المكونات والمسارات في E. القولونية .

في هذه الدراسة، كان الهدف هو المشاركة في التعبير عن خمسة بروتينات من البلازميد واحد. وقد تم شراء الشظايا الاصطناعية المثلى المكونة من خمسة كودون والتي ترميز إما علامات هيكساهستيدين N- أو C- الطرفية تجاريا. تم تضخيم الجينات الاصطناعية عن طريق ير واستنساخها بشكل فردي في ناقلات ير حادة ومتسلسلة. لتوليد البلازميد بوليسيسترونيك، تم استنساخ الجينات الخمسة من الفائدة لأول مرة في البلازميد بمغس المناسب، بمغس-A. ويبين الشكل 2 P...

وتصف هذه الدراسة طرق للتعبير المشترك بوساطة T7 من جينات متعددة من البلازميد واحد في القولونية الإشريكية باستخدام نظام البلازميد بمغس.

مستحلب T7 الحمض النووي الريبي البلمرة بوساطة مولتيجين نظام التعبير، بمغس

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو بناء أوبرونات تخليقية متعددة الجينات تحت تحكم بوليميراز RNA T7 قابل للتحفيز للتعبير عن بروتينات متعددة في آن واحد. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد الباحثين في البيولوجيا التخليقية والكيمياء الحيوية، مما يمكنهم من بناء مسارات بروتينية متعددة أو دراسة المعقدات البروتينية التي تعتمد على التعبير المشترك لنهج متعددة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتعبير عن جينات متعددة في آن واحد في بكتيريا Escherichia coli من بلازميد واحد.سيقوم محمد حسن، طالب الدكتوراه، وأنجيلا تومسون، طالبة التدريب التعاوني، باستعراض الإجراء المتبع في مختبري. بعد الحصول على الجينات المستهدفة وتضخيمها وفقاً للبروتوكول النصي، قم بتحضير تفاعلات الهضم للجين المستهدف الأول وعامل pMGX. باستخدام تفاعل بحجم 40 µL يحتوي على 0.5 إلى 1.5 µg من DNA في إنزيم indel.قم بتحضين التفاعلات عند 37 degree Celsius لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، أضف EcoRI واترك عملية الهضم تستمر لمدة ساعة إضافية. تمت إضافة NdeI قبل EcoRI لضمان إتمام عملية الهضم بفعالية.يعد إنزيم NdeI حساساً لطول الحمض النووي DNA مزدوج السلسلة على كلا جانبي موقع التقييد. لذا فإن إضافته أولاً تضمن قطع البلازميد الدائري كامل الطول. قم بتحميل تفاعلات الهضم على هلام أغاروز بتركيز 0.7%، وأجرِ الرحلان الكهربائي للعينات بجهد 100 فولت لمدة 55 دقيقة.بعد ذلك، وباستخدام مشرط نظيف أو شفرة حلاقة، قم باستئصال حزم القطعة المدرجة والناقل، ثم ضع قطع الجل المستأصلة في أنابيب سعة 1.5 milliliter. استخدم طقم استخلاص الجل وفقاً للبروتوكول المكتوب لتنقية الـ DNA. قم بإعداد تفاعل ربط بحجم 20 microliter يحتوي على 0.15 إلى 0.5 micrograms من الـ vector DNA وكمية مناسبة من القطعة المدرجة بناءً على حجم الجين، بالإضافة إلى واحد microliter من T4 DNA ligase.تحت ظروف تعقيم، قم بإذابة حصص مقدارها 100 µL من خلايا E.coli من سلالة XL1-Blue ذات الكفاءة الكيميائية على الثلج لمدة خمس دقائق. ومن ثم أضف 5 µL من تفاعلات الربط التي تحتوي على الجين المستهدف إلى الخلايا. قم بتحضين عملية التحول على الثلج لمدة 30 دقيقة.بعد ذلك، قم بإجراء صدمة حرارية للخلايا لمدة 45 ثانية في حمام مائي بدرجة حرارة 42 °C. ثم، ضع عينات التحول على الثلج وأضف 200 µL من وسط LB البارد. اترك الخلايا لتحضن لمدة دقيقتين.قم بتحضين الخلايا عند 37 °C وبسرعة 220 rotations per minute لمدة ساعة واحدة، ثم قم بتوزيع 100 µL على أطباق LB agar تحتوي على علامة اختيار مناسبة. ولفحص المستعمرات بحثاً عن المحولات المحتملة، قارن عدد المستعمرات في أطباق التحكم السلبي مقابل أطباق الربط (ligation plates). ويُفضل أن تكون نسبة عدد المستعمرات من واحد إلى اثنين.اختر من أربعة إلى ثماني مستعمرات فردية من كل تفاعل ربط لتلقيح 4 مليلتر من وسط LB مع المضاد الحيوي المناسب. قم بتحضين المزارع عند 37 درجة مئوية و220 دورة في الدقيقة طوال الليل. وباستخدام طقم عزل الحمض النووي البلازميدي، قم بتنقية الحمض النووي البلازميدي وفقاً للبروتوكول المكتوب، ثم جهز تفاعلات هضم بحجم 20 ميكرولتر تحتوي على 150 إلى 500 نانوغرام من DNA باستخدام ميكرولتر واحد من كل من NdeI وEcoRI.قم بتحضين تفاعلات الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. ولإدراج الجين الثاني في ناقل pMGX الذي يحتوي على الجين الأول، قم بإعداد تفاعل هضم بحجم 40 µL يحتوي على 0.5 إلى 1.5 µg من DNA الناقل الذي يحتوي على الجين الأول المستهدف و1 µL من AVR2. قم بتحضين التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة قبل إضافة 1.5 µL من Calf-intestinal phosphatase.قم بالتحضين لمدة 30 دقيقة إضافية. بعد ذلك، قم بتجهيز تفاعل هضم بحجم 40 µL يحتوي على 0.5 إلى 1.5 µg من ناقل pMGX الذي يحتوي على الجين الثاني المطلوب، مع استخدام 1 µL من AVR2 وxpol.قم بتحضين التفاعل عند 37 degree Celsius لمدة ساعتين. ثم قم بإجراء الرحلان الكهربائي لنواتج الهضم التقييدي على هلام أغاروز بتركيز 0.7. واستخدم مبضعاً نظيفاً لاستئصال حزم القطعة المدرجة والناقل كما تم توضيحه سابقاً.بعد استخلاص الحمض النووي البلازميدي وتقدير كمية العينة وفقاً للبروتوكول النصي، قم بإعداد تفاعل ربط باستخدام نسبة 3:1 من القطعة المدرجة إلى الناقل لكل من gene 2 و pMGX-yfg1. تضَمَّن ضابطاً سالباً باستخدام pMGX-yfg1 فقط. قم بتحويل 5 µL من كل تفاعل إلى خلايا XL1-Blue كما تم توضيحه مسبقاً.ثم قارن عدد المستعمرات في أطباق الضابط السلبي وأطباق الربط. إذا وجد عدد كبير من المستعمرات في طبق الضابط السلبي، فراجع عملية المعالجة بـ CIP. اختر من أربعة إلى ثماني مستعمرات فردية من تفاعل الربط واستخدم كل مستعمرة لتلقيح 4 µL من وسط LB مضافاً إليه المضاد الحيوي المناسب.يتم الإنماء عند 37 درجة Celsius وبسرعة 220 دورة في الدقيقة طوال الليل. بعد عزل وتقدير كمية الـ plasmid DNA كما سبق، يتم فحص كفاءة إدراج الجين الثاني عن طريق إعداد تفاعل هضم يحتوي على 150 إلى 500 نانوغرام من الـ DNA وميكروليتر واحد من EcoRI. تُحضن التفاعلات عند 37 درجة Celsius لمدة ساعتين.يُنصح باستخدام EcoRI لأغراض الفحص، ولكن في بعض الحالات، قد ينتج EcoRI قطعتين أو أكثر من المدرجات ذات أحجام متشابهة، مما يجعل من الصعب تمييزها على الهلام. ولضمان النجاح، ينبغي استخدام إنزيم هضم تقييدي بديل مثل NdeI. افصل تفاعلات الهضم على هلام الأغاروز، وابحث عن حزمة تتوافق مع حجم الجين المدرج 2.قم باستنساخ جينات إضافية في البلازميد وفقاً للبروتوكول النصي. ولتوليد البلازميد متعدد السيسترونات، تم أولاً استنساخ الجينات الخمسة في بلازميد مناسب، وهو pMGX A. يوضح هذا الشكل pCR-Blunt-yfg1 و pCR-Blunt-yfg2 في بلازميد pMGX A، بالإضافة إلى pMGX A المهضوم بواسطة indel و EcoRI. ولأجل استنساخ أول جينين في pMGX A، تم هضم البلازميد باستخدام indel و EcoRI.بعد عملية الاستنساخ، تم هضم pMGX-yfg1 وpMGX-yfg2 باستخدام AVR2 وxpol للتأكد من الحصول على مستنسخات ناجحة. يوضح هذا الشكل ناقل pMGXyfg1 المهضوم بواسطة AVR2 وناقل pMGX-yfg2 المهضوم بواسطة AVR2 وxpol لعزل الجين المستهدف الثاني. ثم تم استنساخ القطعة المدرجة الناتجة في pMGX-yfg1 لإنشاء ناقل pMGX-yfg1 two.كما يتضح هنا، أكد هضم pMGX-yfg1 باستخدام EcoRI نجاح استنساخ جين الاهتمام رقم اثنين في pMGX-yfg1. وتُظهر صورة الهلام هذه الفرق بين البلازميدات المهضومة التي كان فيها المقطع المدرج إما في الاتجاه الصحيح أو في الاتجاه العكسي. فإن وجود المقطع المدرج في الاتجاه العكسي سيؤدي إلى ظهور موقعين لـ EcoRI في تقارب شديد، مما يجعل قطع الـ 50 base pair الناتجة عن الهضم غير قابلة للكشف على الهلام ويجعل العمود الفقري أكبر.أخيرًا، وبعد إنشاء ناقل تعبير متعدد السيسترونات (polycistronic expression vector) مكون من خمسة جينات، يؤكد تحليل لطخة وسترن (western blot) للبروتينات المُعبر عنها أن جميع البروتينات الخمسة قد تم التعبير عنها من ناقل واحد. يُلاحظ أن البروتين الناتج عن yfg5 له نفس حجم yfg1 ولا ينفصل على الهلام. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها في غضون ثلاثة أو أربعة أيام لكل جين يتم إدراجه في الهيكل الأساسي pMGX إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.أثناء تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر معالجة الناقل وتخطيطه باستخدام الفوسفاتاز، مثل الفوسفاتاز المعوي للعجول (Calf-intestinal phosphatase)، لإزالة مجموعة الفوسفات من الناقل. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن إجراء تجارب إضافية مثل التعبير عن جينات متعددة داخل الجسم الحي (in vivo) من أجل توصيف وتسخير المسارات الاصطناعية الحيوية لإنتاج المنتجات الطبيعية أو لدراسة المعقدات البروتينية-البروتينية. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا التركيبية لإنتاج الكربوهيدرات المعقدة وبكتيريا E.Coli المعدلة وراثياً.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ نظام التعبير عن الجينات المتعددة في بكتيريا E.coli.

inducible-t7-rna-polymerase-mediated-multigene-expression-system-pmgx

Research

JoVE Journal

Genetics

علم الوراثة

المصدر: بيرينز، سي. وآخرون. تطبيق نظام تعبير محفز لدراسة تداخل عوامل الضراوة البكتيرية مع الإشارات داخل الخلية. J. Vis. Exp. (2015)يوضح هذا الفيديو استخدام نظام تعبير محفز لتحديد المكان الذي يتسبب فيه بروتين المؤثر البكتيري CaeB في تسريع الموتمة المضيفة. يوضح الخطوات اللازمة لتحويل الخلايا المعبرة عن CaeB بنظام يستجيب للتتراسيكلين لتحفيز التعبير الجيني المؤيد للأبوبوتوز بهدف تحديد نقطة الاضطراب داخل السلسلة.

نقل نظام تعبير جيني محفز إلى خلايا تعبر عن بروتين مؤثر بكتيري

يوضح هذا الفيديو نظام التعبير الجيني التتراسيكلين ، أو Tet-On ، في نموذج الفأر. في وجود الدوكسيسيكلين ، وهو مشتق من التتراسيكلين ، يتم تنشيط نظام Tet-On الذي يتكون من بروتين منشط عكسي يتم التحكم فيه بواسطة التتراسيكلين ويعبر عن الجين محل الاهتمام.

التعبير الجيني القائم على النظام القابل للتنظيم المحفز في الجسم الحي: نظام تعبير جيني ناتج عن التتراسيكلين لتنشيط نسخ الجينات المستهدفة في نموذج الفأر

نحن هنا التقرير طريقة لاستخدام النوع الأول والنوع...

التلاعب الجيني في<em&gt; Δku80</em&gt; سلالات لتحليل الجينوم الوظيفي لل<em&gt; التوكسوبلازما جوندياي</em

يحدد هذا البروتوكول لمدة خمسة أيام كل الخطوات والمعدات والبرمجيات اللازمة تكميلية لخلق وتشغيل فعال الذاتية القولونية يستند TX-TL نظام التعبير خالية من الخلايا من الصفر. مع الكواشف، وبروتوكول يأخذ 8 ساعات أو أقل لإعداد رد فعل، وجمع، ومعالجة البيانات.

بروتوكولات لتنفيذ و كولاي وبناء خلية الحرة TX-TL نظام التعبير عن علم الأحياء الاصطناعية

تستخدم الطريقة الموضحة هنا للحث على سلسلة إشارات موت الخلايا المبرمج في خطوات محددة من أجل تشريح نشاط بروتين المستجيب البكتيري المضاد لموت الخلايا المبرمج. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة للتعبير المحفز عن البروتينات المؤيدة لموت الخلايا المبرمج أو السامة ، أو لتشريح التداخل مع مسارات الإشارات الأخرى.

تطبيق نظام التعبير محرض لدراسة التدخل من العوامل البكتيرية الفوعة مع اشارة بين الخلايا

حقن الوريد ذيل هيدرودينامية نواقل التكامل على أساس ينقول تمكن تعداء مستقرة من خلايا الكبد مورين المجراة في. نقدم هنا، بروتوكول عملي لنظم تعداء تمكن التعبير التأسيسي طويل الأجل للتحوير مفردة أو مجتمعة التعبير التأسيسي والدوكسيسيكلين إيندوسيبلي للتحوير أو مير-شرنا في الكبد.

نظم التأسيسي وإيندوسيبلي للتعديل الوراثي في فيفو من خلايا الكبد الماوس باستخدام حقن الوريد ذيل هيدرودينامية

نقدم هنا، بروتوكولا لتحوير التحوير التعبير استخدام تبديل الجين المفرد pEUI(+) بالمعاملة تيبوفينوزيدي.

Ecdysone المستندة إلى مستقبلات فريدة الجينات التبديل للتعبير المتعمد للتحوير مع المتانة وإمكانية الرجوع ويجتازها لا يعتد بها

هذا البروتوكول يحدد الخطوات اللازمة لإنشاء نظام نموذجي الذي النسخ من الجينات الذاتية لمصلحة يمكن التحكم في شروط في الحيوانات الحية أو الخلايا باستخدام قامع المحسن أمريكا اللاتينية والكاريبي و/أو نظم المنشط تيت .

في تطبيق نظام التحكم عن بعد "التلاعب بالتعبير الجيني الذاتية" فيفو

هنا، يصف لنا توليد وتطبيق مجموعة من المعدلة وراثيا التمويل نبات خطوط التعبير إيندوسيبلي، الخاصة بالانسجة مواتية في الخلايا الإنشائية الرئيسية الثلاثة وأرض قمية تبادل لإطلاق النار وأرض قمية الجذر وكامبيوم.

إيندوسيبلي، الخلية المحددة بنوع التعبير في نبات التمويل "عن طريق لحجر" بوساطة ترانس-التنشيط

تصف هذه الدراسة طريقة للتجارب عالية الإنتاجية باستخدام مصفوفة LED مطبوعة ثلاثية الأبعاد لتحسين التعبير الجيني المحفز للضوء في HEK293T الخلايا.

التحسين السريع لنظام محفز للضوء للتحكم في التعبير الجيني للثدييات

تعلم طريقة التعبير المتزامن لجينات متعددة باستخدام نظام بلمرة T7 في Escherichia coli. تُمكّن هذه التقنية الباحثين من دراسة المجمعات البروتينية وبناء المسارات متعددة البروتينات في علم الأحياء الاصطناعي.

مستحلب T7 الحمض النووي الريبي البلمرة بوساطة مولتيجين نظام التعبير، بمغس

استكشف المزيد من الفيديوهات