مستحلب T7 الحمض النووي الريبي البلمرة بوساطة مولتيجين نظام التعبير، بمغس

الهدف العام من هذا الإجراء هو بناء أوبرونات تخليقية متعددة الجينات تحت تحكم بوليميراز RNA T7 قابل للتحفيز للتعبير عن بروتينات متعددة في آن واحد. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد الباحثين في البيولوجيا التخليقية والكيمياء الحيوية، مما يمكنهم من بناء مسارات بروتينية متعددة أو دراسة المعقدات البروتينية التي تعتمد على التعبير المشترك لنهج متعددة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتعبير عن جينات متعددة في آن واحد في بكتيريا Escherichia coli من بلازميد واحد.

سيقوم محمد حسن، طالب الدكتوراه، وأنجيلا تومسون، طالبة التدريب التعاوني، باستعراض الإجراء المتبع في مختبري. بعد الحصول على الجينات المستهدفة وتضخيمها وفقاً للبروتوكول النصي، قم بتحضير تفاعلات الهضم للجين المستهدف الأول وعامل pMGX. باستخدام تفاعل بحجم 40 µL يحتوي على 0.5 إلى 1.5 µg من DNA في إنزيم indel.

قم بتحضين التفاعلات عند 37 degree Celsius لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، أضف EcoRI واترك عملية الهضم تستمر لمدة ساعة إضافية. تمت إضافة NdeI قبل EcoRI لضمان إتمام عملية الهضم بفعالية.

يعد إنزيم NdeI حساساً لطول الحمض النووي DNA مزدوج السلسلة على كلا جانبي موقع التقييد. لذا فإن إضافته أولاً تضمن قطع البلازميد الدائري كامل الطول. قم بتحميل تفاعلات الهضم على هلام أغاروز بتركيز 0.7%، وأجرِ الرحلان الكهربائي للعينات بجهد 100 فولت لمدة 55 دقيقة.

بعد ذلك، وباستخدام مشرط نظيف أو شفرة حلاقة، قم باستئصال حزم القطعة المدرجة والناقل، ثم ضع قطع الجل المستأصلة في أنابيب سعة 1.5 milliliter. استخدم طقم استخلاص الجل وفقاً للبروتوكول المكتوب لتنقية الـ DNA. قم بإعداد تفاعل ربط بحجم 20 microliter يحتوي على 0.15 إلى 0.5 micrograms من الـ vector DNA وكمية مناسبة من القطعة المدرجة بناءً على حجم الجين، بالإضافة إلى واحد microliter من T4 DNA ligase.

تحت ظروف تعقيم، قم بإذابة حصص مقدارها 100 µL من خلايا E.coli من سلالة XL1-Blue ذات الكفاءة الكيميائية على الثلج لمدة خمس دقائق. ومن ثم أضف 5 µL من تفاعلات الربط التي تحتوي على الجين المستهدف إلى الخلايا. قم بتحضين عملية التحول على الثلج لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، قم بإجراء صدمة حرارية للخلايا لمدة 45 ثانية في حمام مائي بدرجة حرارة 42 °C. ثم، ضع عينات التحول على الثلج وأضف 200 µL من وسط LB البارد. اترك الخلايا لتحضن لمدة دقيقتين.

قم بتحضين الخلايا عند 37 °C وبسرعة 220 rotations per minute لمدة ساعة واحدة، ثم قم بتوزيع 100 µL على أطباق LB agar تحتوي على علامة اختيار مناسبة. ولفحص المستعمرات بحثاً عن المحولات المحتملة، قارن عدد المستعمرات في أطباق التحكم السلبي مقابل أطباق الربط (ligation plates). ويُفضل أن تكون نسبة عدد المستعمرات من واحد إلى اثنين.

اختر من أربعة إلى ثماني مستعمرات فردية من كل تفاعل ربط لتلقيح 4 مليلتر من وسط LB مع المضاد الحيوي المناسب. قم بتحضين المزارع عند 37 درجة مئوية و220 دورة في الدقيقة طوال الليل. وباستخدام طقم عزل الحمض النووي البلازميدي، قم بتنقية الحمض النووي البلازميدي وفقاً للبروتوكول المكتوب، ثم جهز تفاعلات هضم بحجم 20 ميكرولتر تحتوي على 150 إلى 500 نانوغرام من DNA باستخدام ميكرولتر واحد من كل من NdeI وEcoRI.

قم بتحضين تفاعلات الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. ولإدراج الجين الثاني في ناقل pMGX الذي يحتوي على الجين الأول، قم بإعداد تفاعل هضم بحجم 40 µL يحتوي على 0.5 إلى 1.5 µg من DNA الناقل الذي يحتوي على الجين الأول المستهدف و1 µL من AVR2. قم بتحضين التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة قبل إضافة 1.5 µL من Calf-intestinal phosphatase.

قم بالتحضين لمدة 30 دقيقة إضافية. بعد ذلك، قم بتجهيز تفاعل هضم بحجم 40 µL يحتوي على 0.5 إلى 1.5 µg من ناقل pMGX الذي يحتوي على الجين الثاني المطلوب، مع استخدام 1 µL من AVR2 وxpol.

قم بتحضين التفاعل عند 37 degree Celsius لمدة ساعتين. ثم قم بإجراء الرحلان الكهربائي لنواتج الهضم التقييدي على هلام أغاروز بتركيز 0.7. واستخدم مبضعاً نظيفاً لاستئصال حزم القطعة المدرجة والناقل كما تم توضيحه سابقاً.

بعد استخلاص الحمض النووي البلازميدي وتقدير كمية العينة وفقاً للبروتوكول النصي، قم بإعداد تفاعل ربط باستخدام نسبة 3:1 من القطعة المدرجة إلى الناقل لكل من gene 2 و pMGX-yfg1. تضَمَّن ضابطاً سالباً باستخدام pMGX-yfg1 فقط. قم بتحويل 5 µL من كل تفاعل إلى خلايا XL1-Blue كما تم توضيحه مسبقاً.

ثم قارن عدد المستعمرات في أطباق الضابط السلبي وأطباق الربط. إذا وجد عدد كبير من المستعمرات في طبق الضابط السلبي، فراجع عملية المعالجة بـ CIP. اختر من أربعة إلى ثماني مستعمرات فردية من تفاعل الربط واستخدم كل مستعمرة لتلقيح 4 µL من وسط LB مضافاً إليه المضاد الحيوي المناسب.

يتم الإنماء عند 37 درجة Celsius وبسرعة 220 دورة في الدقيقة طوال الليل. بعد عزل وتقدير كمية الـ plasmid DNA كما سبق، يتم فحص كفاءة إدراج الجين الثاني عن طريق إعداد تفاعل هضم يحتوي على 150 إلى 500 نانوغرام من الـ DNA وميكروليتر واحد من EcoRI. تُحضن التفاعلات عند 37 درجة Celsius لمدة ساعتين.

يُنصح باستخدام EcoRI لأغراض الفحص، ولكن في بعض الحالات، قد ينتج EcoRI قطعتين أو أكثر من المدرجات ذات أحجام متشابهة، مما يجعل من الصعب تمييزها على الهلام. ولضمان النجاح، ينبغي استخدام إنزيم هضم تقييدي بديل مثل NdeI. افصل تفاعلات الهضم على هلام الأغاروز، وابحث عن حزمة تتوافق مع حجم الجين المدرج 2.

قم باستنساخ جينات إضافية في البلازميد وفقاً للبروتوكول النصي. ولتوليد البلازميد متعدد السيسترونات، تم أولاً استنساخ الجينات الخمسة في بلازميد مناسب، وهو pMGX A. يوضح هذا الشكل pCR-Blunt-yfg1 و pCR-Blunt-yfg2 في بلازميد pMGX A، بالإضافة إلى pMGX A المهضوم بواسطة indel و EcoRI. ولأجل استنساخ أول جينين في pMGX A، تم هضم البلازميد باستخدام indel و EcoRI.

بعد عملية الاستنساخ، تم هضم pMGX-yfg1 وpMGX-yfg2 باستخدام AVR2 وxpol للتأكد من الحصول على مستنسخات ناجحة. يوضح هذا الشكل ناقل pMGXyfg1 المهضوم بواسطة AVR2 وناقل pMGX-yfg2 المهضوم بواسطة AVR2 وxpol لعزل الجين المستهدف الثاني. ثم تم استنساخ القطعة المدرجة الناتجة في pMGX-yfg1 لإنشاء ناقل pMGX-yfg1 two.

كما يتضح هنا، أكد هضم pMGX-yfg1 باستخدام EcoRI نجاح استنساخ جين الاهتمام رقم اثنين في pMGX-yfg1. وتُظهر صورة الهلام هذه الفرق بين البلازميدات المهضومة التي كان فيها المقطع المدرج إما في الاتجاه الصحيح أو في الاتجاه العكسي. فإن وجود المقطع المدرج في الاتجاه العكسي سيؤدي إلى ظهور موقعين لـ EcoRI في تقارب شديد، مما يجعل قطع الـ 50 base pair الناتجة عن الهضم غير قابلة للكشف على الهلام ويجعل العمود الفقري أكبر.

أخيرًا، وبعد إنشاء ناقل تعبير متعدد السيسترونات (polycistronic expression vector) مكون من خمسة جينات، يؤكد تحليل لطخة وسترن (western blot) للبروتينات المُعبر عنها أن جميع البروتينات الخمسة قد تم التعبير عنها من ناقل واحد. يُلاحظ أن البروتين الناتج عن yfg5 له نفس حجم yfg1 ولا ينفصل على الهلام. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها في غضون ثلاثة أو أربعة أيام لكل جين يتم إدراجه في الهيكل الأساسي pMGX إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

أثناء تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر معالجة الناقل وتخطيطه باستخدام الفوسفاتاز، مثل الفوسفاتاز المعوي للعجول (Calf-intestinal phosphatase)، لإزالة مجموعة الفوسفات من الناقل. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن إجراء تجارب إضافية مثل التعبير عن جينات متعددة داخل الجسم الحي (in vivo) من أجل توصيف وتسخير المسارات الاصطناعية الحيوية لإنتاج المنتجات الطبيعية أو لدراسة المعقدات البروتينية-البروتينية. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا التركيبية لإنتاج الكربوهيدرات المعقدة وبكتيريا E.Coli المعدلة وراثياً.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ نظام التعبير عن الجينات المتعددة في بكتيريا E.coli.