بروتوكول للثقافة السريع بعد الوفاة خلية من منتشر الجوهرية جسري بالورم الدبقي (DIPG)

الهدف العام من بروتوكول زراعة الخلايا السريع بعد الوفاة هو توليد مزارع خلايا دائمة مشتقة من المريض من الورم الدبقي الجسري الجوهري المنتشر لتسهيل التجارب اللازمة لفهم وتطوير علاجات فعالة ل DIPG في نهاية المطاف. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول البيولوجيا الأساسية والاستراتيجيات العلاجية للورم الدبقي الجسري الجوهري المنتشر ، مثل ما إذا كانت بعض الأدوية تعمل عبر ثقافات مختلفة مشتقة من المريض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالدراسة المباشرة لبيولوجيا الخلايا المشتقة من المريض.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج DIPG ، لأنها تسمح باختبار استراتيجيات علاجية مختلفة عبر أنواع فرعية وراثية مختلفة من المرض. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على DIPG ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أمراض أخرى ، مثل الأورام الدبقية الأخرى عالية الدرجة لدى الأطفال ، أو الأورام الأرومية الدبقية للبالغين ، أو أورام الجهاز العصبي المركزي الأخرى. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه التقنية ، لأنه من الصعب الحصول على عينات تشريح الجثة ومعالجتها بسرعة بطريقة فعالة.

قبل تحضير العينة ، قم بتعقيم غطاء مزرعة الأنسجة ، جنبا إلى جنب مع شفرات الحلاقة ، ومرقئ المنحني ، وغيرها من الأدوات غير المعقمة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعة واحدة ، وقم بتنفيذ جميع الخطوات التالية في ظل ظروف معقمة. بعد ذلك ، انقل الأنسجة إلى طبق ثقافة خلية عالي الجدران 100 ملم × 20 ملم. قم بإزالة الوسائط المتبقية من الشحن ، واستبدلها ب 10 إلى 15 مل من وسائط الثقافة الباردة.

بعد ذلك ، باستخدام مرقئ النصف المنحني للإمساك بشفرة الحلاقة ، قم بفرم الأنسجة جيدا أثناء إزالة الأوعية الدموية أو السحايا. يجب أن تكون شظايا الأنسجة النهائية أصغر من ملليمتر واحد. بعد ذلك ، انقل الأنسجة إلى أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 ملليلترا.

اغسل طبق زراعة الخلية بخمسة ملليلتر إضافية من وسائط الزراعة الباردة وانقل العينة إلى الأنبوب المخروطي. كرر خطوة الغسيل هذه حسب الضرورة لنقل الأنسجة المتبقية. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر، قم بترطيب العينة برفق لمدة أربع إلى خمس مرات.

اسمح لشظايا الأنسجة الكبيرة بالاستقرار في قاع الأنبوب. إذا لزم الأمر ، قم بالطرد المركزي للعينة لفترة وجيزة لمدة دقيقة واحدة. لجمع الكسر المنفصل ، قم بإزالة المادة الطافية وترشيحها من خلال مرشح 100 ميكرون في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مليلتر يسمى التفكك الميكانيكي.

اقلب الفلتر فوق الأنبوب المخروطي الأصلي واغسله بوسائط الثقافة لاستعادة شظايا الأنسجة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لجزء التفكك الميكانيكي لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية من جزء التفكك الميكانيكي المحبب وأعد تعليق الأنسجة في وسط الثقافة الباردة.

إذا كان هناك أكثر من خمسة ملليلتر من الأنسجة في الأنبوب المخروطي للتفكك الميكانيكي ، فقم بتقسيم الأنسجة إلى أنابيب مخروطية أخرى سعة 50 مليلتر بحيث لا يحتوي أي أنبوب على أكثر من خمسة ملليلتر من الأنسجة. بعد ذلك ، قم بتخزين الجزء المنفصل ميكانيكيا على الجليد حتى خطوة الطرد المركزي المتدرج للسكروز. في هذا الإجراء ، قم بالطرد المركزي للأنبوب المخروطي الذي يحتوي على شظايا الأنسجة المتبقية لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية وأضف محلول الهضم الأنزيمي الدافئ مسبقا ، بحيث يكون هناك خمسة ملليلتر من محلول الهضم لكل مليلتر واحد من الأنسجة. بعد ذلك ، أغلق غطاء الأنبوب المخروطي بغشاء مختبري واحتضان التفاعل على دوار عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بتقطيع العينات برفق.

باستخدام ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر، قم بتحريك العينة لأعلى ولأسفل لمدة ست إلى ثماني مرات، وتجنب توليد فقاعات هواء زائدة. بعد ذلك، أضف طرف ماصة سعة 1,000 ميكرولتر إلى نهاية الماصة وقم بترتيب العينة لمدة ست إلى ثماني مرات إضافية. اسمح لأي قطع متبقية بالاستقرار في قاع الأنبوب.

بعد ذلك ، قم بإزالة وتصفية المادة الطافية مع استمرار تعليق الخلايا من خلال مرشح 100 ميكرون في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مليلتر يسمى التفكك الأنزيمي وتخزينه على الجليد. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لأنبوب التفكك الأنزيمي لمدة خمس دقائق ، واستمر في الطرد المركزي المتدرج للسكروز. إذا كانت العينة لا تزال معلقة في المحلول ، فقم بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الأنسجة في 20 مل من HBSS البارد بدون الكالسيوم والمغنيسيوم. ثم ارفع الحجم إلى 25 مل مع HBSS البارد. أضف ببطء 25 مل من محلول السكروز المولي 1.8 ، واقلب الأنبوب للخلط.

ينتج عن هذا تدرج سكروز 0.9 مولار. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة دون انقطاع لمدة 10 دقائق. استنشق بعناية بقايا المايلين في أكبر قدر ممكن من محلول السكروز.

ثم اغسل العينة بإضافة 30 مل من HBSS البارد بدون الكالسيوم والمغنيسيوم ، والخلط برفق. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق. في هذا الإجراء ، قم بإزالة المادة الطافية للغسيل.

أضف خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت لتحلل ACK, وأعد تعليق حبيبات الخلية برفق, تحريك الأنبوب لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بإخماد التحلل بإضافة 30 مل من HBSS البارد بدون الكالسيوم والمغنيسيوم. بعد ذلك ، قم بجهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق.

أعد تعليق حبيبات الخلية النهائية في 10 إلى 15 مل من TSM الكامل الدافئ مع عوامل النمو ، وحدد كثافة الخلايا القابلة للحياة على مقياس كثافة الدم ، باستخدام استبعاد Trypan blue. بعد ذلك ، انقل تعليق الخلية النهائي إلى قارورة ثقافة T75 جديدة. إضافة عوامل نمو إضافية كل يومين للحفاظ على مستويات عامل النمو الإجمالية, ومراقبة لتطوير الخلايا العصبية الخلايا السرطانية.

فيما يلي أمثلة مختلفة لكيفية ظهور العينات من المراحل الأولى من الثقافة إلى ثقافة دائمة. في البداية ، غالبا ما لا يبدو أن الثقافات المطلية والمبكرة تحتوي على العديد من الخلايا الباقية. علاوة على ذلك ، غالبا ما لا تظهر مجموعات الخلايا المبكرة درجة التباين المرتبطة عادة بالمجالات العصبية.

ومع ذلك ، فإن المرور الأولي لمجموعات الخلايا هذه ، جنبا إلى جنب مع الترشيح العكسي لمجموعات الخلايا ، يمكن أن يعزل الخلايا السرطانية السليمة القادرة على تكوين المجالات. يحتوي المرشح عادة على بقايا الحطام. يمكن بعد ذلك الاحتفاظ بهذه العينات المشتقة من المريض في الثقافة لممرات متعددة.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ثلاث إلى أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم التأكد من الحفاظ على العينة في درجة حرارة باردة من خلال كل خطوة باستثناء التفكك الأنزيمي ، وتقليل التعامل المؤلم مع العينة. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء دراسات إضافية ، مثل فحص الأدوية في المختبر ، أو التطعيم الغريب ، للإجابة على الأسئلة اللاحقة حول علم الأحياء المرضي DIPG.

بعد تطويرها ، مهدت تقنية الثقافة هذه الطريق للباحثين في مجال الأورام العصبية للأطفال لاستكشاف طرق علاجية جديدة للأطفال المصابين ب DIPG. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فكرة جيدة عن كيفية إجراء بروتوكولات زراعة الخلايا السريعة بعد الوفاة على عينات أورام الدماغ. لا تنس أن العمل مع الأنسجة البشرية يمكن أن يكون خطيرا ، ويجب دائما استخدام الاحتياطات ، مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية والتقنية المعقمة.