اثنين من الخوارزميات لإنتاجية عالية ومتعدد حدودي الكمي ل ذبابة الفاكهة عصبي عضلي مفرق الصرف

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد السمات المورفولوجية للتقاطع العصبي العضلي ذبابة الفاكهة تلقائيا باستخدام وحدات ماكرو البرامج المورفومترية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تحديد منظمي تطور المشبك ، وهو سؤال رئيسي في علم الأعصاب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القياس الكمي التلقائي لميزات NMJ المتعددة.

هذا يسمح بالتحليل الموضوعي لمورفولوجيا NMJ في عال من خلال وضع. قررنا تطوير هذه المنهجية لنكون قادرين على التحقيق في مورفولوجيا NMJ في كمية كبيرة من نماذج الأمراض. فكرنا في طرق كيفية منع خلافاتهم الشخصية وكيفية تسريع عملية القياس الكمي بشكل كبير.

العرض المرئي لهذه الطريقة مفيد للغاية. تعد إعدادات الماكرو المناسبة أمرا بالغ الأهمية وقد تكون بعض الخطوات صعبة على المستخدمين الجدد ، خاصة عندما لا تكون على دراية ببرنامج VT. بالنسبة لهذا البروتوكول، قم بإنشاء مجموعات صور من NMJs واحفظها كملفات TIFF فردية، حيث تعرض القناة الأولى تلطيخ DLG1، أو علامة مماثلة، وتعرض القناة الثانية تلطيخ BRP.

للبدء ، قم بإنشاء إسقاطات C ومكدسات فائقة لملفات صور NMJ. افتح خيارات المكون الإضافي وحدد ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics. الآن ، حدد سلسلة الملفات الفريدة التي عينها المجهر لسلسلة الصور عند تخزينها ك TIFF.

سيكون هذا في نهاية اسم الصورة. انسخ والصق السلسلة المعطاة إلى أدنى مستوى ورقم قناة في نافذة إعداد سلسلة الملف الفريدة. ثم حدد تحويل الماكرو الفرعي إلى مكدس واختر الدليل أو المجلد الذي توجد به الصور.

لكل ملف صورة، يتم إنشاء ملفين جديدين باستخدام مكدس الأسماء الافتراضي والمكدس المسطح، متبوعا باسم الصورة الأصلي. يمكن بعد ذلك حذف الملفات الأصلية لتوفير مساحة التخزين. بعد ذلك ، من ذبابة الفاكهة NMJ واجهة Morphometrics ، حدد الماكرو الفرعي لعائد الاستثمار ، واختر دليل ملف الصورة.

عند فتح الإسقاط الأول ، حدد أداة التحديدات اليدوية. ثم استخدم الماوس لتحديد منطقة تحتوي على محطة NMJ كاملة ذات أهمية. بمجرد التحديد، انقر فوق موافق في نافذة تعريف المحطة الطرفية.

استمر في القيام بذلك حتى يتم تحديد أطراف NMJ في جميع التوقعات. يقوم الماكرو بتقدم العملية تلقائيا. لكل ملف صورة ، يتم إنشاء ملف جديد واحد بالأسماء الافتراضية ROI متبوعا باسم الصورة الأصلي.

لتحديد ميزات NMJ ، انتقل أولا إلى واجهة ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics وقم بتعيين المقياس. على سبيل المثال، إذا كان بكسل واحد في الصورة يتوافق مع 0.72 ميكرون، فقم بتعيين وحدات بكسل المقياس إلى واحد ومسافة القياس إلى 0.072. ثم حدد تحليل الماكرو الفرعي وإذا كانت هناك صورتان للقناة ، فقم أيضا بتبديل الوزن.

اضغط على موافق وعندما يطلب منك ذلك، حدد دليل ملف الصورة. يمكن أن يكون وقت المعالجة عدة دقائق لكل مشبك. بعد التحليل ، يتم تخزين ملفات الصور الجديدة لكل مشبك تم تحليله في المجلد الأبوي والقياسات الكمية هي النتائج.

txt. افحص جميع الصور واستبعد الصور التي تحتوي على أخطاء في التجزئة. على سبيل المثال، قد لا يتم تضمين أجزاء من الطرف المشبكي في المخطط الأصفر.

قد يتم تضمين أجزاء من الخلفية في الطرف المشبكي. قد يمتد خط الهيكل العظمي الأزرق إلى ما وراء الطرف المشبكي. قد يكون هناك عدد كبير جدا من المناطق النشطة، أو قد تظل بعض المناطق النشطة غير مكتشفة.

إذا كانت أكثر من 5٪ من الصور بها أخطاء في التجزئة، فاستكشف خوارزميات تحليل مختلفة لتحسين معالجة الصور. تصف أقسام الفيديو القادمة كيفية تحديد العديد من إعدادات تحليل الماكرو هذه. لضبط قيمة نصف قطر الكرة المتدحرجة للماكرو، حدد ثلاثة إسقاطات NMJ Z تمثل مجموعة بيانات الصورة.

احذف اسم الصورة النتيجة res واسم صورة مكدس منطقتين نشطتين، تم إنشاؤه مسبقا بواسطة تحليل الماكرو الفرعي. افتح ملفات اسم الصور المكدس لكل صورة محددة ثم من شريط الأدوات حدد تقسيم القنوات لإنشاء صورة للقناة الأولى وصورة للقناة الثانية وحفظ هذه الملفات. افتح الصورة التي تنتمي إلى القناة الأولى ، والتي تتوافق في هذه الحالة مع DLG واحدة وسم المناعة.

الآن ، قم بتشغيل خلفية طرح المرشح ، الموجودة أسفل علامة تبويب العملية. اضبط نصف قطر الكرة المتدحرجة على قيمة تزيد من التباين بين المشبك والخلفية. قم بإنشاء إسقاط Z بنوع الإسقاط كأقصى كثافة واحفظ الصورة.

ثم قم بتشغيل خوارزمية الخلفية الطرحية مع نصف قطر الكرة المتدحرجة الجديد على جميع إسقاطات Z واحفظ النتائج. لتحديد أفضل عتبات تلقائية للماكرو، افتح إسقاطات C المحفوظة وقم بتشغيل عتبة تلقائية باستخدام خيار تجربة الكل. من الصور الناتجة ، ابحث عن الخوارزمية الأنسب للصور وتابع استخدام إعداد الحد هذا عند تشغيل الماكرو لمزيد من الصور.

تحديد العتبات التلقائية المختلفة ، من الأهمية بمكان تجزئة الصورة المناسبة بواسطة الماكرو. لهذا السبب ، لتحديد ثمانية من معلمات اللافتات بشكل صحيح ، لذلك من المهم أن تكون على دراية بخيارات عتبة السيارات ال 16 التي يوفرها البرنامج. اضغط على زر علامة الجمع لتكبير صورة نتيجة العتبة التلقائية.

أسماء الخوارزميات أسفل كل صورة نتيجة. في هذا المثال، أفضل خوارزمية عتبة تلقائية لإعداد عتبة مخطط NMJ هي هوانغ. بالنسبة لعتبة الهيكل العظمي ، فإن أفضل إعداد هو Li ، وأفضل إعداد لعتبة المنطقة النشطة هو Huang.

لتحديد قيمة تحمل الضوضاء القصوى الدقيقة للماكرو، ارجع إلى صور NMJ التمثيلية الأصلية. افتح قناة BRP. انتقل إلى علامة التبويب المكونات الإضافية في القائمة المنبثقة وحدد الحد الأقصى 3D.

بعد فترة قصيرة ، ستظهر صورة جديدة ، ثم أغلق الصورة الأصلية. بعد ذلك ، استخدم الأمر 3D الأدنى. ثم أغلق الحد الأقصى لمكدسات C2 ، قم بتشابك صورة واحدة وحدد الصورة التي تم إنشاؤها حديثا كحد أقصى لمكدس C2 ، وتشابك واحد.

الآن استخدم الأمر find maxima. في النافذة الجديدة، حدد تحديد نقطة المعاينة واضبط تفاوت الضوضاء على 50. ثم يشار إلى النقاط القصوى بتهجينات صغيرة ، والتي يجب أن تغطي فقط المناطق النشطة للمشبك العصبي.

إذا تم إجراء عدد كبير جدا من الصلبان ، فقم بزيادة قيمة تحمل الضوضاء. إذا لم يتم تعليق بعض المناطق النشطة ، فقم بتقليل قيمة تحمل الضوضاء. استخدم قيمة العتبة المشتقة لحقل تحديد الحد الأقصى لتحمل الضوضاء للماكرو.

عند اختيار قيمة تحمل الضوضاء القصوى ، من المهم تحديد عدد المناطق النشطة بشكل صحيح. في بعض الأحيان يكون من الضروري تجربة قيم مختلفة لتحديد القيم المناسبة. الآن اضبط جميع القيم المشتقة في خوارزميات العتبة في واجهة الماكرو وقم بتشغيل تحليل الماكرو الفرعي على الصور التمثيلية التي تم استخدامها في الأصل لتحديد إعدادات الماكرو.

سيتم إنشاء ملف جديد بالمناطق النشطة المشار إليها بالنقاط البيضاء. افتح هذا الملف عن طريق سحبه وإفلاته في شريط الأدوات وتحديد مشروع Z بنوع إسقاط كبعض الشرائح. وبالتالي ، يتم عمل ملف إسقاط.

الخطوة التالية هي ضبط العتبة. في نافذة العتبة الجديدة، حرك الشريط العلوي لاختيار قيمة عتبة حيث تتم قراءة جميع البؤر المطلوبة. هذه هي النقاط الإيجابية لخطة السلام البرازيلية.

استخدم هذه القيمة كحد أدنى لنقطة BRP. الآن ، أعد تشغيل التحليل على صور NMJ التمثيلية الأصلية باستخدام القيم والخوارزميات المحددة مسبقا ، ثم قيمة عتبة BRP puncta الجديدة الجديدة. يجب أن تفي الصور الناتجة بمعايير التحليل النقدي.

استخدم الآن إعدادات التعريف لتشغيل الماكرو على جميع صور NMJ التي تم الحصول عليها في ظل نفس الظروف. ذبابة الفاكهة NMJ تم استخدام الماكرو لالتحقق من صحة العيوب المشبكية المختلفة المعروفة في ثلاثة أنماط وراثية متحولة. من المعروف أن Ankyrin اثنين من الطفرات قد دمجت العروات و NMJs الأصغر.

باستخدام الماكرو ، تم قياس مساحة ومحيط panuronil و quirin ، تم قياس اثنين من RNAI لإسقاط NMJs ووجد أنهما أصغر بكثير من الضوابط. GTPase Rab3 مطلوب لتوزيع bruckpila بشكل صحيح. عند التعطيل ، يكون هناك عدد أقل من المناطق النشطة.

باستخدام panuronil macro Rab 3 ، كان لدى الذباب القاطي 138 منطقة نشطة في المتوسط لكل محطة NMJ مقارنة ب 290 تم اكتشافها في الضوابط. يعتبر الأسلاك العالية منظما مهما لنمو NMJ وعندما تمتد NMJs المتحولة في أطرافها. أظهر استخدام خطوط RNAI ذات الأسلاك العالية الكبيرة زيادات كبيرة في العديد من المعلمات المشتقة من الهيكل العظمي في NMJs الخاصة بها ، بما في ذلك الطول الإجمالي وأطول طول فرع وعدد الفروع وعدد النقاط المتفرعة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشغيل وضبط إعدادات ذبابة الفاكهة NMJ الماكرو morphometrics. بمجرد إتقان تحليل 50 نقاط الاشتباك العصبي يمكن إجراؤها في غضون ساعة واحدة. هذا يوفر ما يقرب من 15 دقيقة من وقت القياس الكمي لكل مشبك عصبي.

من المهم الحصول على صور عالية الجودة ل NMJ. كلما كانت الصور أفضل ، كان أداء الماكرو أفضل. ستساعد هذه التقنية الباحثين في مجال علم الأعصاب على تحديد المعلمات المورفولوجية لذبابة الفاكهة NMJ بكفاءة.