على طريقة تجميع خلية فعالة ومرنة ل3D كروي الإنتاج

المعلق للراوي: الهدف العام من هذه الطريقة هو توليد كميات كبيرة من كرويات الخلايا القوية بكفاءة عن طريق تجميع الخلايا لاستخدامها في مجموعة متنوعة من المقايسات القائمة على الخلايا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم مصفوفة غير بروتينية قابلة للذوبان في الماء لتجميع الخلايا وتكوين كروي ، مما يسمح بعزل سهل وسريع للكرويات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في اكتساب رؤى جديدة في بيولوجيا الخلية حول تأثيرات تفاعلات الخلية والخلية / المصفوفة على نمو الأنسجة في بيئة مكروية ثلاثية الأبعاد.

المعلق الأول قبل تحضير الركام ، سخني 50 مل من الماء عالي النقاء إلى 80 درجة مئوية ، وأضيفي 10 جرامات من مسحوق ميثيل السليلوز. حرك التعليق حتى تتشتت الجسيمات بالتساوي. ثم أضف الماء البارد فائق النقاء إلى الحجم النهائي البالغ 100 مل ، وقم بتخزين الجزيئات طوال الليل عند 4 درجات مئوية حتى يصبح المحلول صافيا ولون القش بدون مواد صلبة مرئية.

مرر المحلول عبر مرشح 0.45 ميكرومتر لإزالة أي شظايا غير مذابة ، وقم بتخفيف 1: 5 ملليغرام لكل مليلتر من المحلول المصفى في وسط الثقافة المناسب. ثم قم بتصفية الوسط المكمل بميثيل السليلوز من خلال مصفاة 0.22 ميكرومتر. بعد ذلك ، في خزانة السلامة الحيوية ، اغسل ثقافة فرعية متجمعة بنسبة 70٪ باستخدام PBS ، وقم بإرفاق الخلايا بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت لارتباط Trypsin-EDTA في حاضنة زراعة الخلايا.

بعد بضع دقائق ، افحص الخلايا تحت المجهر الضوئي بتكبير 10x. عندما ترفع الخلايا من اللوحة ، قم بتحييد التفاعل بسبعة ملليلتر من وسط الثقافة المكملة بالمصل. انقل محلول الخلية إلى أنبوب جديد سعة 15 مليلتر ، ثم اجمع الخلايا المحررة عن طريق الطرد المركزي.

السبب الأكثر شيوعا لتكوين كروي غير ناجح ، بصرف النظر عن الجسيمات الملوثة ، هو استخدام تركيزات دون المستوى الأمثل من ميثيل السليلوز أو المصل لتجميع ونمو خط الخلايا الخاص بك. المعلق الأولي - باستخدام ماصة دقيقة P1000 بطرف مرشح ، قم بتقطيع البليت ثلاث إلى خمس مرات باستخدام مليلتر واحد من وسط تكوين الكروي ، واضغط على طرف الماصة على قاع الأنبوب بزاوية طفيفة ، مع سحب الماصة ببطء دون طرد محتويات الطرف بالكامل لمجرد الحبيبات. بعد العد، قم بتخفيف معلق الخلية إلى 1 في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل تركيز مليلتر، واشطف خزان ماصة معقم متعدد القنوات بماء فائق النقاء مفلتر لإزالة أي غبار وألياف.

قم بتوزيع الخلايا في الخزان واستخدم أطراف المرشح لنقل 100 ميكرولتر من الخلايا إلى كل بئر من صفيحة طارد الخلايا ذات القاع U سعة 96 بئرا ، وخلط تعليق الخلية بشكل دوري لمنع الخلايا من الاستقرار في قاع الخزان. عندما تجلس جميع الخلايا ، ضع اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة وافحص الآبار يوميا بحثا عن تكوين كروي. يجب أن تستقر الخلايا في قاع كل بئر في غضون ست ساعات ، وتتجمع بشكل عام في شكل كروي في غضون 24 إلى 48 ساعة.

لتأكيد تكوين كروي ناجح ، استخدم طرف P10 تحت المجهر الضوئي لوضع وسط الماصة برفق فوق الكروي. سوف تتحلل الكرويات المشكلة بشكل صحيح من اللوحة واللفة ، مما يؤكد هيكلها ثلاثي الأبعاد. لتضمين الكرات في الكولاجين، استخدم سحب العينات العكسي لتغطية قاع كل بئر من شريحة غرفة زراعة أنسجة الآبار بثمانية آبار بالتساوي مع ما لا يقل عن 50 ميكرولترا من الكولاجين المحايد لكل بئر.

عندما يتم تغطية جميع الآبار ، ضع شريحة الغرفة في طبق زراعة أنسجة 35 ملم مملوء بالماء فائق النقاء في طبق زراعة الأنسجة بطول 10 سم واحتضان طبق زراعة الأنسجة 10 سم عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة تقريبا. عندما يتبلمر الكولاجين ، استخدم طرف مرشح P1000 لنقل الكرات الكروية مسبقة التشكيل بعناية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ملليلتر. من الأهمية بمكان أن يتم تحضين طبقات قاعدة الكولاجين حتى يتم بلمرتها بالكامل لتجنب إزعاج الكولاجين عند إضافة الكرات أو الوسط.

الراوي: اجمع الكرويات المحصودة في جهاز طرد مركزي صغير على سطح الطاولة ، واستخدم ماصة P200 لإزالة المواد الطافية ، والتخلص من أي مادة طافية زائدة عن طريق انعكاس الأنبوب على منشفة ورقية نظيفة حسب الضرورة. باستخدام طرف ماصة P200 عريض التجويف، أعد تعليق الكرويات على الفور في 50 ميكرولترا من الكولاجين المحايد وانقل مخاليط الكولاجين الكروية بعناية إلى كل بئر من شريحة غرفة زراعة أنسجة الآبار الثمانية. أعد الشريحة إلى الحاضنة حتى يتبلمر الكولاجين.

بعد حوالي ساعة ، أضف ببطء ما لا يقل عن 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع الدافئ الذي يحتوي على المعالجة المناسبة ذات الأهمية لكل بئر لحضانة أخرى. ثم استخدم المجهر الفلوري للحصول على أقسام التصوير البصري من خلال الكرويات الغازية. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن إنشاء الكرويات من مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا.

في ظل ظروف معالجة ميثيل السليلوز والمصل المناسبة ، تستقر الخلايا الفردية وتلتصق ببعضها البعض في وسط البئر لتشكيل كرويات مع الحد الأدنى من الالتصاق بقاع البئر. بعض خطوط الخلايا قادرة على الالتصاق بألواح طاردة للخلايا في حالة عدم وجود أو بتركيزات منخفضة من ميثيل السليلوز ، مما يؤدي إلى تكوين كروي محاط بطبقة أحادية الخلية. بشكل عام ، تمنع التركيزات العالية من ميثيل السليلوز الخلايا من الالتصاق بالبئر.

لكن التركيز المرتفع جدا من ميثيل السليلوز يقلل من التصاق الخلية بالخلية ، ويمنع الخلايا من الاستقرار في قاع البئر ، مما يؤدي إلى تكوين مجاميع فضفاضة والعديد من الأقمار الصناعية الكروية. يمكن معالجة الكرويات المضمنة في الكولاجين بجاذب كيميائي للحث على غزو الخلايا الفردية إلى الخارج من الكروي إلى المصفوفة المحيطة. يمكن تصوير الأجسام الكروية المدمجة في الكولاجين الثابت عن طريق المجهر الميداني الساطع لتحديد مسافة وعدد الخلايا الغازية ، أو عن طريق الفحص المجهري المناعي لتصور الهياكل الغازية التي تشكلها الخلايا المهاجرة.

من المهم إتاحة الوقت الكافي للخلايا لتتجمع في كرويات سليمة من الناحية الهيكلية تكون قوية بما يكفي للتلاعب بها دون تجزئة ، ويمكن جمعها بسهولة لاستخدامها في المقايسات اللاحقة. يمكن تكييف بروتوكول نمو الخلايا الخاص بنا بشكل أكبر مع فحوصات بيولوجيا الخلايا المتعددة. على سبيل المثال ، يمكن استخدام وضع الخلايا في وسائط مكملة بتركيزات عالية من ميثيل السليلوز لتقييم مقاومة السليلوز.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد كرويات خلوية ثلاثية الأبعاد عن طريق التجميع ، والتي ستكون أداة قيمة للعديد من تطبيقات بيولوجيا الخلية.