على طريقة تجميع خلية فعالة ومرنة ل3D كروي الإنتاج

السارد: يهدف هذا الأسلوب بشكل عام إلى إنتاج كميات كبيرة من الكريات الخلوية القوية بكفاءة عن طريق التجميع الخلوي لاستخدامها في مجموعة متنوعة من المقاييس القائمة على الخلايا. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في استخدام مصفوفة قابلة للذوبان في الماء وغير بروتينية للتجميع الخلوي وتكوين الكريات، مما يسمح بعزل الكريات بسهولة وسرعة. ويمكن أن يساعد هذا الأسلوب في اكتساب رؤى جديدة في بيولوجيا الخلية حول تأثيرات التفاعلات بين الخلية والخلية، وبين الخلية والمصفوفة على نمو الأنسجة في بيئة مجهرية ثلاثية الأبعاد.

السارد: قبل تحضير التجمعات، سخّن 50 ملليلتر من الماء فائق النقاء إلى 80 درجة مئوية، وأضف 10 جرامات من مسحوق ميثيل السليلوز. قم برجّ المعلق حتى تتوزع الجسيمات بشكل متساوٍ. ثم أضف ماءً فائق النقاء بارداً حتى يصل الحجم النهائي إلى 100 ملليلتر، واحفظ الجسيمات طوال الليل عند 4 درجات مئوية حتى يصبح المحلول رائقاً وذا لون قشي دون وجود مواد صلبة مرئية.

مرر المحلول عبر مرشح بقطر 0.45 ميكرومتر لإزالة أي شظايا غير ذائبة، ثم خفف 1:5 mg/mL من المحلول المرشح في وسط استزراع مناسب. بعد ذلك، قم بترشيح الوسط المكمل بـ methylcellulose عبر مصفاة بقطر 0.22 ميكرومتر. بعد ذلك، وفي خزانة السلامة البيولوجية، اغسل مزرعة فرعية وصلت درجة تلاقي خلاياها إلى 70% باستخدام PBS، ثم قم بفصل الخلايا باستخدام ثلاثة mL من منظم Trypsin-EDTA في حاضنة زراعة الخلايا.

بعد بضع دقائق، افحص الخلايا تحت مجهر ضوئي بتكبير 10x. عندما تنفصل الخلايا عن الطبق، قم بتحييد التفاعل باستخدام سبعة مليلترات من وسط زراعي مكمل بالمصل. انقل محلول الخلايا إلى أنبوب جديد سعة 15 مليلتر، ثم اجمع الخلايا المتحررة عن طريق الطرد المركزي.

إن السبب الأكثر شيوعاً لفشل تكوين الكريات، إلى جانب الجزيئات الملوثة، هو استخدام تركيزات غير مثالية من الميثيل سليلوز أو المصل لتجميع ونمو الخط الخلوي المحدد الخاص بك. المعلق- باستخدام ماصة ميكروية P1000 ذات طرف مرشح، قم بتجانس الراسب من ثلاث إلى خمس مرات باستخدام 1 mL من وسط تكوين الكريات، مع الضغط بطرف الماصة مقابل قاع الأنبوب بزاوية طفيفة، مع السحب والضخ ببطء دون إفراغ كامل محتويات الطرف لقص الراسب. بعد العد، خفف معلق الخلايا إلى تركيز 1 × 10⁴ خلية/mL، واشطف خزان الماصة متعددة القنوات المعقم بماء فائق النقاء مرشح لإزالة أي غبار أو ألياف.

قم بتوزيع الخلايا في الخزان واستخدم رؤوس ماصة مزودة بمرشحات لنقل 100 µL من الخلايا إلى كل بئر من بئر لوحة خلايا ذات قاع على شكل حرف U مكونة من 96 بئراً ومضادة لالتصاق الخلايا، مع خلط معلق الخلايا بشكل دوري لمنع ترسب الخلايا في قاع الخزان. بمجرد استقرار جميع الخلايا، ضع اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة وافحص الآبار يومياً لمراقبة تشكّل الكريات. يجب أن تستقر الخلايا في قاع كل بئر خلال ست ساعات، وتتجمع عموماً لتكوين كرية خلال 24 إلى 48 ساعة.

للتأكد من تكوين كروية خلوية ناجحة، استخدم طرف ماصة P10 تحت مجهر ضوئي لسحب الوسط الغذائي بلطف فوق الكروية الخلوية. ستنفصل الكرويات الخلوية المتكونة بشكل صحيح عن الطبق وتتدحرج، مما يؤكد بنيتها ثلاثية الأبعاد. ولتضمين الكرويات الخلوية في الكولاجين، استخدم تقنية السحب العكسي (reverse pipetting) لتغطية قاع كل بئر في شريحة غرفة زراعة الأنسجة ذات الثمانية آبار بالتساوي، وبكمية لا تقل عن 50 microliters من الكولاجين المُعادل لكل بئر.

عند تغطية جميع الآبار، ضع شريحة الغرفة في طبق زراعة أنسجة مقاس 35 مليمتر مملوء بالماء فائق النقاء داخل طبق زراعة أنسجة مقاس 10 سنتيمتر، ثم قم بتحضين طبق زراعة الأنسجة مقاس 10 سنتيمتر عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة تقريبًا. وبمجرد بلمرة الكولاجين، استخدم رأس ترشيح P1000 لنقل الكريات مسبقة التشكيل بعناية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مليلتر. من الضروري تحضين طبقات قاعدة الكولاجين حتى تتبلمر تمامًا لتجنب تعريض الكولاجين للاضطراب عند إضافة الكريات أو الوسط الزرعي.

المعلق: اجمع الكريات المجمعة في جهاز طرد مركزي صغير مكتبي، واستخدم ماصة P200 لإزالة السوائل الطافية، مع امتصاص أي سوائل زائدة عن طريق قلب الأنبوب على مناديل ورقية نظيفة حسب الضرورة. وباستخدام رأس ماصة P200 واسع الفتحة، أعد تعليق الكريات فوراً في 50 µL من الكولاجين المتعادل، وانقل مخاليط الكولاجين والكريات بعناية إلى كل بئر من آبار شريحة غرفة زراعة الأنسجة ذات الثمانية آبار. أعد الشريحة إلى الحاضنة حتى يتكون بوليمر الكولاجين.

بعد مرور ساعة تقريباً، أضف ببطء 100 µL على الأقل من الوسط الزرعي الدافئ الذي يحتوي على المعالجة المطلوبة إلى كل بئر لفترة حضانة أخرى. بعد ذلك، استخدم مجهراً فلورياً لالتقاط مقاطع تصوير بصري عبر الكريات الغازية. وباستخدام هذا البروتوكول، يمكن توليد كريات من مجموعة متنوعة من الخطوط الخلوية.

في ظل ظروف المعالجة المناسبة بالميثيل سليلوز والمصل، تترسب الخلايا الفردية وتلتصق معاً في مركز البئر لتشكل كرويات ذات التصاق أدنى بقاع البئر. وتستطيع بعض الخطوط الخلوية الالتصاق بالأطباق الطاردة للخلايا في غياب الميثيل سليلوز أو عند تركيزاته المنخفضة، مما يؤدي إلى تكوين كروية محاطة بطبقة أحادية من الخلايا. وبشكل عام، تمنع التركيزات الأعلى من الميثيل سليلوز الخلايا من الالتصاق بالبئر.

لكن التركيز المرتفع جداً من ميثيل السليلوز يقلل من الالتصاق بين الخلايا، ويمنع الخلايا من الاستقرار في قاع البئر، مما يؤدي إلى تكوين تجمعات مفككة والعديد من الكريات التابعة. ويمكن معالجة الكريات المغمورة في الكولاجين بمادة جاذبة كيميائياً لتحفيز غزو الخلايا الفردية من الكرية إلى المصفوفة المحيطة. كما يمكن تصوير الكريات المغمورة في الكولاجين والمثبتة باستخدام مجهر المجال المضيء لقياس المسافة وعدد الخلايا الغازية، أو باستخدام مجهر التألق المناعي لتصور الهياكل الغازية التي شكلتها الخلايا المهاجرة.

من المهم إتاحة وقت كافٍ للخلايا لتتجمع في شكل كرويات (spheroids) سليمة هيكلياً وقوية بما يكفي لمعالجتها دون أن تتجزأ، وبحيث يمكن جمعها بسهولة لاستخدامها في المقايسات اللاحقة. ويمكن تكييف بروتوكول نمو الخلايا الخاص بنا بشكل أكبر ليتناسب مع مقايسات متعددة في بيولوجيا الخلية. فعلى سبيل المثال، يمكن استخدام وضع الخلايا في أوساط مضاف إليها تركيزات عالية من الميثيل سليلوز (methylcellulose) لتقييم المقاومة الخلوية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية توليد كرويات خلوية ثلاثية الأبعاد عن طريق التجميع، والتي ستكون أداة قيمة للعديد من تطبيقات بيولوجيا الخلية.