التوليد الكروي من خطوط الخلايا: طريقة زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد)

تنمو خط الخلايا المطلوب كطبقة أحادية ثنائية الأبعاد ملتصقة. قم بإزالة وسائط الثقافة واغسلها بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات أو PBS. ثم أضف التربسين واحتضن بينما تنفصل الخلايا عن سطح القارورة وتصبح مستديرة الشكل. أضف وسائط جديدة لتحييد التربسين وتعليق الخلايا. انقل الخليط إلى أنبوب مخروطي الشكل ، واستخدم جهاز طرد مركزي لتكسير الخلايا.

استبدل المادة الطافية بوسائط جديدة وأعد تعليق حبيبات الخلية. استخدم مقياس كثافة الدم لحساب أرقام الخلايا وحساب تركيز العمل. بعد ذلك ، انقل الكمية المناسبة من مزيج الخلايا إلى صفيحة بئر منخفضة الالتصاق منخفضة القاع واحتضنها. تستقر الخلايا في القاع وتتراكم. سوف ترتبط في النهاية ببعضها البعض وتشكل مجموعة خلية ثلاثية الأبعاد مدمجة ، كروية.

في مثال البروتوكول ، سنرى كيفية توليد كرويات ثلاثية الأبعاد من خط خلايا سرطان القولون ، وكيف يتم تطبيق التصوير الحي لتتبع تكوينها. ابدأ بغسل خط خلايا سرطان القولون والمستقيم محل الاهتمام بخمسة ملليلتر من PBS ، وإزالة الخلايا من قاع القارورة باستخدام 0.5 مل من التربسين لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد تأكيد الانفصال تحت المجهر ، قم بتحييد إنزيم تفكك الخلية ب 10 ملليلتر من الوسط الكامل ، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من الوسط الكامل الطازج للعد, وأعد تعليق الخلايا عند 1.5 في 10 إلى الخلايا الثالثة لكل تركيز المليلتر.

ثم قم بزرع 20 ميكرولترا من الخلايا في كل بئر من صفيحة مستديرة القاع مكونة من 96 بئرا ، ثم ضع اللوحة في جهاز تصوير آلي داخل حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 و 95٪ رطوبة. قم بتسجيل الدخول إلى برنامج الاستحواذ الخاص بالجهاز ، وحدد جدولة للحصول عليها ، وإطلاق إضافة سفينة ، والمسح الضوئي في الموعد المحدد ، وإنشاء سفينة ، جديد. بعد ذلك ، حدد نوع المسح الضوئي ، Spheroid وحدد قنوات Brightfield و Fluorescence المناسبة ذات الأهمية. اضبط التكبير على 10 مرات وحدد طراز اللوحة وموضعها داخل درج جهاز التصوير. حدد موضع الآبار المراد تصويرها وأدخل وصف التجربة ، بما في ذلك الاسم ونوع الخلايا وعدد الخلايا.

بالنسبة لإعداد التحليل، حدد تأجيل التحليل حتى وقت لاحق، وانقر بزر الماوس الأيمن فوق المخطط الزمني، وحدد تعيين الفاصل الزمني لمجموعة المسح المحدد، وقم بتعيين إضافة عمليات فحص كل أربع ساعات، ولمدة تصل إلى 24 ساعة. ثم اضبط وقت البدء على ساعة واحدة على الأقل بعد الحضانة في جهاز التصوير الآلي. للتحقق من تقدم نمو الكروية، كل يومين، قم بتسجيل الدخول إلى برنامج التصوير وحدد عرض عمليات المسح الحديثة. انقر نقرا مزدوجا فوق التجربة التي تهمك وحدد Brightfield في لوحة Image Channels. ثم استخدم أداة قياس ميزات الصورة لقياس قطر الكرات الكروية. إضافة 50 ميكرولتر من الوسط الكامل لكل بئر في اليوم الرابع للحد من أي وسيط من تأثيرات الظهور.