جيل متغيرات الهروب من تحييد الأجسام المضادة فيروس الإنفلونزا

الهدف العام من هذه الطريقة هو توفير بروتوكول عمل حول كيفية توضيح الحاتمة (epitope) لجسم مضاد أحادي النسيلة معادِل. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجالات علم المناعة وعلم الفيروسات، والتي من شأنها المساعدة في تحديد التفاعلات بين المضيف والفيروس، وتطوير العلاجات وأدوات التشخيص، وكل ذلك يمكن أن يساعد في تصميم اللقاحات. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية تنفيذها باستخدام تقنيات زراعة الأنسجة والبيولوجيا الجزيئية الأساسية دون الحاجة إلى أدوات أو معدات خاصة.

سيقوم بتوضيح هذا الإجراء مارك بيلي، وهو طالب دكتوراه وحاصل على درجة MD من مختبر بيتر باليزي. ابدأ هذا الإجراء بتوصيف الأجسام المضادة بناءً على تثبيط التلازن الدموي (hemoagglutination inhibition)، أو HI، وأنشطة التعادل كما هو موضح في البروتوكول النصي. يتم تحليل الأجسام المضادة المعادِلة التي تمتلك نشاط HI بشكل أكبر من خلال تحضير أربعة تخفيفات من الجسم المضاد المعني بتركيزات متزايدة في محلول PBS بتركيز 1x وبحجم 100 µL لكل تخفيف.

بعد ذلك، قم بتحضير مخزون فيروسي بتركيز مليون وحدة مكونة للبقع لكل ملليلتر في محلول PBS بتركيز 1× في حجم 400 µL. ثم، اخلط 100 µL من الفيروس بتركيز مليون وحدة مكونة للبقع لكل ملليلتر مع 100 µL من كل تخفيف للأجسام المضادة أو 100 µL من محلول PBS بتركيز 1×. قم بتحضين العينات لمدة ساعة واحدة في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C مع 5% CO₂.

بعد الرج بجهاز الفورتكس لفترة وجيزة، يتم حقن 200 µL من كل خليط في بيض دجاج ملقح وخالٍ من مسببات الأمراض المحددة. بعد ذلك، تُحضن البيضات عند 37 °C بدون CO2 لمدة تتراوح من 40 إلى 44 ساعة. وعقب فترة التحضين، يتم إعدام البيض الملقح المصاب بالفيروس عن طريق وضعه في درجة حرارة 4 °C لمدة ست ساعات على الأقل.

بعد ذلك، يتم جمع السائل السلوي من البيض كما تم وصفه سابقاً. وأخيراً، يتم تأكيد المتغيرات الهروبية عن طريق إجراء مقايسة تثبيط الهماجلوتينين (HI assay) كما هو موضح في البروتوكول النصي. ولتوليد متغيرات هروبية ضد الأجسام المضادة المعادلة التي تفتقر إلى نشاط تثبيط الهماجلوتينين، يجب تمرير الفيروس في وجود كميات متزايدة من الأجسام المضادة.

قم بزراعة خلايا MDCK في طبق سداسي الفجوات بكثافة مليون خلية لكل فجوة. قم بحضن الخلايا لمدة لا تقل عن أربع ساعات في حاضنة عند درجة حرارة 37°C مع 5% carbon dioxide. وفي هذه الأثناء، قم بتخفيف المخزون الفيروسي ليصل إلى مليون وحدة تشكيل لويحة لكل ملليلتر.

قم بتحضير تخفيف واحد من الجسم المضاد بتركيز 0.02 milligrams per milliliter في وسط MEM بتركيز 1× مع trypsin المعالج بـ TPCK بحجم 250 microliter. استخدم تركيزات أعلى من الجسم المضاد في جميع الممرات التالية. اخلط 250 microliters من الفيروس المخفف مع 250 microliters من الجسم المضاد المخفف، أو 250 microliters من وسط MEM بتركيز 1× كعينة ضابطة خالية من الأجسام المضادة.

يُحضن خليط الفيروس والأجسام المضادة لمدة 30 دقيقة في حضانة عند درجة حرارة 37°C مع 5% من ثاني أكسيد الكربون. وبعد حضن الخلايا، يُسحب الوسط باستخدام ماصة باستور زجاجية وتُغسل الطبقة الأحادية من الخلايا باستخدام 1 mL من محلول PBS بتركيز 1×. تُضاف 500 µL من الخلائط إلى الآبار قبل الحضن في حضانة عند درجة حرارة 37°C مع 5% من ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة.

بعد مرور ساعة واحدة، أضف إلى الآبار 2 mL من وسط MEM بتركيز 1x يحتوي على تربسين معالج بـ TPCK. افحص الخلايا بعد 48 ساعة من العدوى بحثاً عن علامات التأثير المرضي الخلوي، أو CPE، باستخدام المجهر، أو قم بإجراء اختبار التلازن الدموي للكشف عن النمو الفيروسي. في حال وجود نمو CPE في المزرعة المضاف إليها الجسم المضاد، قم بجمع السائل الطافي في أنابيب تجميد متعددة.

قم بتسمية الأنابيب برقم الممر (passage number) واحفظها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. احتفظ بـ 100 µL من الطافي لإصابة طبقة أحادية جديدة من خلايا MDCKs باستخدام 2 mL من MEM بتركيز 1× مضاف إليه TPCK trypsin والأجسام المضادة. تذكر تضمين ضابط خالي من الأجسام المضادة لكل ممر.

قم بزيادة تركيز الجسم المضاد في كل ممر متتالٍ حتى يظل نمو الفيروس قابلاً للاستمرار، حتى مع التركيز النهائي البالغ 0.6 milligrams per milliliter من الجسم المضاد. قم بتجميد عدة قوارير من الطافي لكل ممر وتخزينها عند درجة حرارة minus 80 degrees Celsius. استمر في عزل وتحليل المتغيرات الناجية كما هو موضح بالتفصيل في البروتوكول النصي.

استُخدمت الأجسام المضادة المحفزة باللقاح، والتي عُزلت من أفراد تطعيموا بلقاح إنفلونزا A المرشح H7N9، لتوليد متغيرات طافرة هاربة. وكشف رسم خرائط الطفرات الهاربة أن العديد من الأجسام المضادة تعرفت على بقايا حرجة في مواقع متميزة على HA الفيروسي. يمثل كل بقايا، والمشار إليه باللون الأحمر، موقع الأحماض الأمينية الحرجة المطلوبة للارتباط الفعال بجسم مضاد أحادي النسيلة، بينما تمتلك غالبية الأجسام المضادة الإيجابية لـ HI بقايا طافرة هاربة بالقرب من المواقع المستضدية المبلغ عنها سابقاً لـ H7HA. أما الأجسام المضادة السلبية لـ HI فقد ولدت طفرات هاربة ذات طفرات نقطية في منطقة الساق.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تطبيقها لتوضيح المحددات الهيكلية للحماية ضد مسببات الأمراض الأخرى. ولا تقتصر هذه التقنية على توليد متغيرات الهروب للأجسام المضادة أحادية النسيلة فحسب، بل تشمل أيضاً المركبات المضادة للفيروسات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توضيح الحاتمة الرابطة للأجسام المضادة أحادية النسيلة عن طريق توليد متغيرات الهروب في المختبر (in vitro).

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر توخي الحذر عند التعامل مع الفيروسات واستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة.