طريقة محسنة لجمع السائل الدماغي النخاعي من الفئران تخديره

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحسين جمع السائل الدماغي النخاعي من الفئران دون تلوث من الدم. توفر هذه الطريقة طريقة سهلة وموثوقة لجمع السائل الدماغي النخاعي لمراقبة المؤشرات الحيوية للأمراض العصبية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الإضافة مع المعالج الدقيق للمساعدة في جمع السائل الدماغي النخاعي من الفئران تقلل من تلوث الدم أثناء التجميع.

ابدأ بوضع شعيرات دموية زجاجية مسحوبة في حامل شعري مثبت بإحكام على مناور دقيق. بعد ذلك ، أثناء المشاهدة من خلال مجهر تشريح ، استخدم ملقطا مستقيما لكسر طرف الشعيرات الدموية الحادة بحيث يكون القطر الداخلي للطرف المكسور حوالي 10 إلى 20 ميكرون. ثم قم بتوصيل أنبوب رفيع وحقنة بالطرف الآخر من حامل الشعيرات الدموية ، وقم بتوصيل الأنبوب الرفيع والحقنة بصمام ثلاثي الاتجاهات وقم بتحويل الصمام ثلاثي الاتجاهات لفتحه.

ثم اغمر المحقنة لطرد أي ملوثات وخلق ضغط إيجابي في الأنبوب الشعري. كرر ذلك عدة مرات عن طريق فصل المحقنة وإعادة توصيلها بالصمام ثلاثي الاتجاهات. ثم اسحب الهواء إلى 100 إلى 200 ميكرولتر قبل إعادة التوصيل النهائي للحقنة بالصمام ثلاثي الاتجاهات.

حرك المعالج الدقيق مع الشعيرات الدموية الزجاجية إلى الجانب لمنع التلف أثناء العملية الجراحية. قبل البدء في الجراحة ، تأكد من تخدير الفأر بالكامل عن طريق الضغط على الأطراف الأربعة وملاحظة عدم وجود رد فعل. ثم استخدم مقص تشريح لقص وقص الشعر في الجزء الخلفي من رأس الفأر من فوق العينين بين الأذنين إلى أسفل الرقبة.

قم بتأمين رأس الماوس باستخدام محول ماوس الإطار التجسيمي. تأكد من أن الرأس لا يمكن أن يتحرك وتثبيته بإحكام في المحول عن طريق الضغط برفق على رأس الماوس. استخدم المقص والملقط المنحني لقطع جلد الفأر عبر مؤخرة العنق ثم أسفل منتصف الجمجمة بين أذني وعيني الفأر.

اسحب الجلد والأنسجة بعيدا عن المنطقة فوق صهريج ماجنا. أثناء المشاهدة من خلال مجهر التشريح ، قم بتشريح آخر طبقات رقيقة من العضلات بعناية فوق قاعدة الجمجمة باستخدام ملقط وحرك طبقات العضلات هذه إلى الجانب وخارج منطقة الاهتمام. بمجرد أن تتعرض الجافية فوق الصهريج الماجنا ، استخدم برعم قطن مبلل لمسح الغشاء ثم استخدم برعم قطن جاف لتجفيف المنطقة.

يبدو الصهريج الماغنا مثلثا مع واحد أو اثنين من الأوعية الدموية الكبيرة التي تمر عبر المنطقة. يعتبر جانبي الأوعية الدموية أو بينهما مثاليا لإدخال الشعيرات الدموية وجمع السائل الدماغي النخاعي. بمجرد أن تتعرض الصهريج الماغنا، استخدم المعالج الدقيق لمحاذاة الشعيرات الدموية الزجاجية مع الجزء الخلفي من رأس الماوس بحيث تكون النقطة الحادة خلف الغشاء مباشرة بزاوية 30 إلى 45 درجة.

بعد ذلك ، اغمر المحقنة مرة واحدة أو عدة مرات ثم حرك المكبس للخلف من 100 إلى 200 ميكرولتر للتأكد من عدم وجود ملوثات ووجود ضغط سلبي في الشعيرات الدموية الزجاجية. ثم حرك الطرف الشعري بالقرب من الغشاء حتى يمكن رؤية المقاومة ، ولكن دون ثقب الغشاء. اطرق أدوات التحكم في أداة المعالجة الدقيقة للنقر برفق على الأنبوب الشعري عبر الغشاء.

يجب سحب السائل الدماغي النخاعي تلقائيا إلى الأنبوب الشعري بمجرد ثقب الفتحة. اترك الشعيرات الدموية في مكانها لتجميع السائل الدماغي النخاعي ببطء. إذا توقف السائل الدماغي النخاعي عن التدفق ، فاسحب المحقنة ببطء لأعلى حوالي 50 ميكرولتر لخلق المزيد من الضغط السلبي في الشعيرات الدموية.

يتم جمع عشرة إلى 15 ميكرولترا من السائل الدماغي النخاعي في 10 إلى 30 دقيقة. بمجرد جمع الحجم المطلوب من السائل الدماغي النخاعي ، أغلق الأنبوب عن طريق تحريك الصمام ثلاثي الاتجاهات لإغلاق وإزالة المحقنة المتصلة بالأنبوب. افتح الأنبوب ثم أغلقه لإنشاء ضغط متساو في الشعيرات الدموية والأنبوب والمنطقة خارج الشعيرات الدموية.

ثم أعد توصيل المحقنة قبل إزالة الشعيرات الدموية الزجاجية برفق من الماوس باستخدام أداة المعالجة الدقيقة. بعد ذلك ، ضع أنبوب التجميع الذي يحتوي على ميكرولتر واحد من مثبط البروتياز 20X تحت النقطة الحادة للشعيرات الدموية الزجاجية. افتح الأنبوب واغمر المحقنة برفق.

يجب أن يتدفق السائل الدماغي النخاعي من الشعيرات الدموية إلى أنبوب التجميع. بعد الجمع ، قم بجهاز الطرد المركزي النبضي للأنبوب الدماغي النخاعي لخلط العينة مع مثبط الإنزيم البروتيني في الجزء السفلي من أنبوب التجميع. يمكن اقتباس عينات السائل الدماغي النخاعي ثم تخزينها لمزيد من التحليل عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

أظهر السائل الدماغي النخاعي الذي تم جمعه من الفئران APP / PS1 زيادة كبيرة في مستويات بيتا A البشري 42 في عمر 12 شهرا. في الفئران البرية ، لم يتم اكتشاف أي إنسان بيتا 42. بمجرد إتقانه ، يمكن تنفيذ هذا الإجراء في ساعة واحدة إذا تم تنفيذه بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تجنب الأوعية الدموية عند إدخال الشعيرات الدموية وإجراء تعديلات طفيفة فقط مع معالج دقيق أثناء جمع السائل الدماغي النخاعي لتجنب التلوث بالدم.