استكشاف أدوار القوى المادية في أوائل Morphogenesis الجنينية الفرخ

الهدف العام لهذا البروتوكول التجريبي هو دراسة دور القوى الميكانيكية في نمو الدماغ الجنيني المبكر من خلال تجارب ex ovo. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأحياء التنموي والميكانيكا الحيوية ، مثل أدوار الإشارات الميكانيكية في تكوين التشكل ، وهو توليد الشكل البيولوجي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تمكن من توصيف دور القوى الميكانيكية في التشكل على مستوى الأنسجة والكائن الحي.

لبدء هذا الإجراء ، استخدم مناديل رقيقة تحتوي على 70٪ من الإيثانول لتنظيف بيض الدجاج الأبيض المخصب الخالي من مسببات الأمراض. ثم رتب البيض في اتجاه طولي على حامل. بعد ذلك ، اضبط حاضنة البيض على درجة حرارة مستهدفة تبلغ 37.5 درجة مئوية ، وحافظ على الرطوبة عند 48 إلى 55٪ يتم التحكم في الرطوبة عن طريق إضافة كمية مناسبة من الماء إلى الحاضنة.

احتضن البيض لمدة 40 إلى 44 ساعة تقريبا إلى HH11 إلى 13. بعد ذلك ، اترك البيض يبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 30 دقيقة تقريبا قبل التنظيف بنسبة 70٪ من الإيثانول. في هذه الخطوة ، اكسر البيض من الأسفل ، وافصل القشرة برفق ، وقم بإيداع المحتويات بعناية في طبق بتري مقاس 150 × 15 ملم.

للتأكد من أن جانب الجنين لأعلى ، احتفظ بالبويضات في نفس الاتجاه الذي تم احتضانه فيه أثناء تكسيرها. قم بإزالة الألبومين الرقيق باستخدام ماصة باستور التي تستخدم لمرة واحدة. افصل الألبومين السميك عن الصفار باستخدام الملقط غير الحاد.

تأكد من إزالة الألبومين السميك عن طريق كشط الجزء العلوي من الصفار برفق. بعد ذلك ، باستخدام ملقط رفيع الرؤوس ، ضع حلقة من ورق الترشيح فوق الجنين وقم بتوسيطها ، مع مطابقة المحور الطويل للحلقة مع المحور الطويل للجنين. بعد ذلك ، قم بقص صفار البيض المحيط بحلقة ورق الترشيح بالمقص.

بعد ذلك ، اسحب الحلقة والجنين من صفار البيض في اتجاه مائل باتجاه الموقع الذي تم فيه قطع صفار البيض لأول مرة. ثم اشطف الجنين في طبقين متسلسلين 100 ملم مع PBS بدرجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، ضع حلقة من ورق الترشيح في طبق بتري مقاس 35 ملم.

ضع الجانب الظهري للجنين لأعلى على ورق الترشيح الآخر في طبق بتري مقاس 35 ملم. بعد ذلك ، ضع حلقة من الفولاذ المقاوم للصدأ فوق شطيرة ورق الترشيح. احرص على عدم إتلاف الجنين.

الآن ، أضف ثلاثة ملليلتر من CCM المعد مسبقا إلى كل طبق بتري. قم بإزالة الغشاء الزجاجي لكل جنين عن طريق قشط الإبرة الشعرية المسحوبة برفق عبر الجزء العلوي من الجنين. ثم قم بتقشير غشاء vitelline بعيدا ، بدءا من الطرف الأمامي والانتقال إلى الحبل الظهري.

بعد ذلك ، ضع ثمانية أطباق بتري مقاس 35 ملم في طبق واحد مقاس 150 ملم مبطن بمناديل مشبعة بالماء للحفاظ على الرطوبة. بعد ذلك ، ضع طبق بتري مقاس 150 ملم في كيس بلاستيكي قابل للغلق ، واملأ الكيس بخليط غاز يتكون من 95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. أغلق الكيس وضعه في حاضنة 37.5 درجة مئوية.

الآن ، قم بإزالة الجنين من الحاضنة ، واستخدم نظام OCT لتصويره وتحديد الزاوية الالتوائية للأنبوب العصبي. انقل الأجنة إلى مجهر ضوئي ، وتصورها بتكبير 10 أضعاف. استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر لإزالة 0.2 مل من الوسائط تدريجيا من طبق بتري.

التقط صورا ساحلية ساطعة بعد كل جولة من إزالة الوسائط لمراقبة تأثير واجهة الوسائط والهواء على الجنين. استمر في إزالة الوسائط حتى يؤدي التوتر السطحي عبر الجنين إلى الالتواء. قم بتصوير الجنين باستخدام نظام OCT مرة أخرى لإنشاء زاوية التواء نهائية للمقارنة مع الأجنة الضابطة.

لتغيير اتجاه حلقة القلب ، استخدم زوجا من الملقط لقلب ورق الترشيح بحيث يصبح الجنين جانبا بطنيا لأعلى. بعد ذلك ، استخدم الأنبوب الشعري المسحوب لفتح شق في الغشاء الحشوي وممارسة قوة ميكانيكية لدفع القلب من الجانب الأيمن إلى الجانب الأيسر. ضع التوتر السطحي للسائل لإبقاء القلب على الجانب الأيسر.

ثم احتضان الجنين لمدة 20 ساعة أخرى لرؤية التغيير في تماثل الالتواء. يظهر هنا جنين تم حصاده مع إزالة VM في HH11. تم تحضين نفس الجنين لمدة 27 ساعة بعد إزالة VM مما أظهر انخفاضا في الالتواء.

هنا هو نفس الجنين الذي خضع لالتواء في الدماغ عند تطبيق التوتر السطحي السائل ، وهنا هو الجنين الضابط مع التواء الدماغ الطبيعي في مرحلة مماثلة. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم توخي الحذر حتى لا تتلف الجنين. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تحليل العناصر المحدودة من أجل نمذجة حسابية لكيفية تأثير القوى الفيزيائية على التشكل.

لذلك ، مهدت هذه التقنية التي تم تطويرها هنا الطريق لدراسات مستقبلية حول ميكانيكا التشكل في أجنة الكتاكيت. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تفهم كيفية حصاد أجنة الكتاكيت للزراعة في المختبر ، وإزالة غشاء vitelline جراحيا دقيقيا ، وتلخيص القوة التي يوفرها غشاء vitelline ، ومراقبة التشكل الجنيني من خلال OCT والتصوير الميداني الساطع.