استهدفت تسلسل الجيل القادم وأنابيب المعلوماتية الحيوية لتقييم المحددات الوراثية للمرض الدستورية

الهدف العام من تسلسل الجيل التالي المستهدف هو توضيح المحددات الجينية لمختلف الأمراض الدستورية من خلال التركيز على المناطق الجينومية ذات الأهمية الخاصة. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بالأيديولوجية الجينية للمرض ، خاصة عندما تكون هناك ارتباطات وراثية معروفة سابقا. هذه التقنية عالية الكفاءة.

إنه ينتج ملايين القراءات في فترة زمنية قصيرة ، ونحصل عليها بتكلفة منخفضة نسبيا ، وهناك عبء حسابي منخفض نسبيا ، خاصة عندما نقارنها بأساليب التسلسل الأخرى من الجيل التالي. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تشخيص الأمراض التنكسية العصبية ، والتي تكون غير متجانسة ظاهريا ووراثيا ، ولكن لها العديد من المواقع الجينية المرتبطة المعروفة. على الرغم من أن هذه الطريقة موجهة بشكل خاص نحو الأمراض التنكسية العصبية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على العديد من الأمراض الدستورية الأخرى ذات الأهمية الجينومية المحددة مسبقا.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن معالجة المعلوماتية الحيوية المطلوبة للتحليل النهائي للمتغيرات النادرة يمكن أن تكون مكثفة من الناحية الحسابية وتخلق العديد من مصادر الخطأ. في هذا الإجراء ، يتم جمع عينات الدم البشري في ثلاثة أو أربعة أنابيب ملليلتر EDTA K2 لتوفير حجم إجمالي يبلغ حوالي 12 ملليلترا. الطرد المركزي لعينات الدم بجاذبية 750 مرة لمدة 20 دقيقة.

سيؤدي ذلك إلى تقسيم كل عينة إلى مرحلة علوية من البلازما ، ومرحلة متوسطة رقيقة من الكريات البيض ، ومرحلة سفلية من كريات الدم الحمراء. قم بإخراج البلازما من الجزء العلوي من عينة الدم باستخدام ماصة نقل يمكن التخلص منها. استغنى عنها في عدة حصص 500 ميكرولتر وخزنها عند سالب 80 درجة مئوية للتحليل الكيميائي الحيوي في المستقبل.

استخرج الحمض النووي من عينة الدم باستخدام مجموعة استخراج الدم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم يتم استخدام الحمض النووي المستخرج لإعداد مكتبة تسلسل لتسلسل الجيل التالي. بمجرد اكتمال تشغيل التسلسل، على جهاز كمبيوتر، ابحث عن الملفات داخل بيئة الحوسبة المستندة إلى السحابة عن طريق تحديد عمليات التشغيل في لوحة التنقل.

حدد تشغيل التسلسل المناسب للانتقال إلى صفحة ملخص التشغيل. حدد تنزيل للحصول على البيانات من السحابة. من مربع الحوار الذي يظهر، حدد ملفات FASTQ كنوع الملف المراد تنزيله وانقر فوق تنزيل.

من صفحة ملخص التشغيل لبيئة الحوسبة المستندة إلى السحابة، انتقل إلى المخططات لتحليل جودة تشغيل التسلسل باستخدام الأرقام المختلفة التي تنتجها بيئة الحوسبة. من صفحة تشغيل المخططات، ابحث عن الشكل المسمى البيانات حسب الدورة، ضمن الرسم البياني حدد الكثافة، وضمن القناة حدد جميع القنوات لإنتاج مخطط شدة الإشارة. ضمن لوحة Run Navigation ، حدد علامة التبويب Indexing QC للعثور على الرسم البياني لمراقبة جودة الفهرسة ، الموجود على الجانب الأيمن من الصفحة.

من صفحة تشغيل الملخص لبيئة الحوسبة المستندة إلى مجموعة النظراء، انقر فوق المقاييس داخل لوحة التنقل تشغيل للانتقال إلى مقاييس الجودة. ضمن كثافة كلفن لكل ملليمتر مربع، تأكد من أن كثافة نظام المجموعة لتشغيل التسلسل ضمن النطاق الموصى به بواسطة مجموعة التخصيب المستخدمة. في هذه الحالة ، 1 ، 200 إلى 1 ، 400 كلفن لكل ملليمتر مربع.

ضمن النسبة المئوية الإجمالية أكبر من أو تساوي Q30 ، تأكد من أن القيمة أكبر من أو تساوي 85٪ مما يعكس جودة قراءات التسلسل. ضمن المحاذاة تأكد من أن القيمة مماثلة للنسبة المئوية للتحكم الإيجابي التي تم تضمينها في تشغيل التسلسل. على سبيل المثال ، إذا تم استخدام عنصر تحكم إيجابي بنسبة 1٪ ، فستكون النسبة المئوية المحاذاة المتوقعة حوالي 1 إلى 5٪ والاختلافات داخل بضع نقاط عشرية مقبولة.

ابدأ هذه العملية عن طريق استيراد قراءات تسلسل FASTQ إلى برنامج معالجة البيانات. داخل منطقة التنقل ، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد مجلد جديد. قم بتسمية المجلد بحيث يكون هناك وضوح فيما يتعلق بتشغيل التسلسل الذي تم إجراؤه.

من شريط الأدوات في الجزء العلوي ، حدد استيراد ومن القائمة المنسدلة ، اختر النظام الأساسي الذي تم إجراء التسلسل به. لأغراض ONDRISeq ، يتم اختيار Ilumina. في مربع الحوار، انتقل إلى ملفات FASTQ وحددها من تشغيل التسلسل الذي تتم معالجته.

من الخيارات العامة لمربع الحوار، انقر فوق المربع الموجود بجوار قراءات مقترنة إذا كان التسلسل يستخدم كيمياء نهاية مقترنة. من معلومات القراءة المقترنة في مربع الحوار، حدد Paired-end إذا ظهر ملف FASTQ للقراءة الأمامية قبل القراءة العكسية في قائمة الملفات. اضبط الحد الأدنى لمسافة القراءة المقترنة على واحد والحد الأقصى للمسافة إلى 1000.

من خيارات Ilumina في مربع الحوار، حدد إزالة القراءات الفاشلة. من القائمة المنسدلة درجة الجودة، حدد مسار NGS الذي تم استخدامه للتسلسل. حدد التالي في أسفل مربع الحوار.

حدد حفظ وإنشاء مجلدات فرعية لكل وحدة دفعية. حدد التالي في أسفل مربع الحوار. اختر المجلد الذي تم إنشاؤه مسبقا.

هذا هو المكان الذي سيتم فيه استيراد ملفات FASTQ. حدد إنهاء في الجزء السفلي من مربع الحوار وانتظر حتى يتم استيراد ملفات FASTQ. انقر فوق علامة التبويب العمليات للاطلاع على حالة استيراد الملف.

بعد ذلك ، قم بتصميم سير عمل داخل البرنامج لإجراء إعادة التسلسل واستدعاء المتغير وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يعد تصميم سير عمل إعادة التسلسل واستدعاء المتغير أصعب جانب في هذا الإجراء. بحث فريقنا عن أفضل الممارسات واستخدم التجربة والخطأ للتوصل إلى أقوى سير عمل يناسب احتياجاتنا.

لتشغيل ملفات قراءة تسلسل FASTQ المستورد من خلال سير عمل المعلوماتية الحيوية المخصص ، ابدأ بتحديد سير العمل في صندوق أدوات البرنامج والنقر فوقه نقرا مزدوجا. داخل مربع الحوار الذي يظهر، حدد موقع مجلدات ملفات FASTQ التي تم استيرادها داخل منطقة التنقل. قم بتمييز كافة المجلدات عن طريق تحديدها داخل منطقة التنقل ثم انقر فوق المربع الموجود بجوار الدفعة.

استخدم السهم المواجه لليمين لنقل الملفات إلى العناصر المحددة. انقر فوق التالي في أسفل مربع الحوار. داخل مربع الحوار، راجع نظرة عامة على الدفعة للتأكد من تحديد ملفات FASTQ الصحيحة ثم انقر فوق التالي.

راجع خطوات سير العمل داخل مربع الحوار للتأكد من تحديد الملفات الصحيحة ومواقع التصدير عند تصميم سير العمل. تتضمن هذه الخطوات تعيين القراءات إلى التسلسل المرجعي ، وإزالة القراءات المعينة المكررة ، وإنشاء إحصائيات للمناطق المستهدفة ، وتصدير ملفات BAM ، وتصدير نص محدد بعلامات جدولة ، والتصفية بناء على التداخل ، وتصدير ملفات VCF. ضمن الخطوة الأخيرة في مربع الحوار، معالجة النتائج، حدد الخيار حفظ في مجلد الإدخال.

انقر فوق إنهاء في أسفل مربع الحوار. تتمثل الخطوة الأخيرة في إجراء تعليق توضيحي متغير على ملف VCF لكل عينة كما هو موضح في بروتوكول النص. تم تطبيق المنهجيات الموضحة في هذا الفيديو على 528 عينة من الحمض النووي للمشاركين من الأفراد المسجلين في ONDRI.

تم تشغيل العينات على لوحة ONDRISeq في 22 تشغيلا من 24 عينة لكل تشغيل. بشكل عام ، تم تحديد بيانات التسلسل لتكون عالية الجودة بمتوسط تغطية عينة 78 مرة. تمت مطابقة متوسط 95.6٪ من القراءات مع التسلسل المرجعي ، وكان لجميع عمليات تشغيل ONDRISeq أكثر من 90٪ من القراءات التي تم تعيينها.

من القراءات المعينة ، 92.0٪ ودرجة Phred أكبر من أو تساوي Q30. لإثبات فائدة سير عمل NGS المستهدف هذا ، يتم تقديم مثال لرجل يبلغ من العمر 68 عاما ، مريض مرض باركنسون ، يظهر انخفاض N على الإنتاج. يتم تنسيق التباين المشروح لتحديد تلك التي من المرجح أن تكون ذات أهمية سريرية ، كما هو موضح في المربعات الحمراء.

عند تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تلبية الخطوات المناسبة لمنصة التسلسل ومجموعة التخصيب التي تم استخدامها واحتياجات البحث. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الوراثة للحصول على بيانات عالية الجودة خاصة بالمنطقة مع بقائها أقل تكلفة من نظيراتها في الإكسوم والجينوم الكامل.