تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9

الهدف العام لهذا البروتوكول هو تحقيق اضطراب جيني سريع وفعال من خلال CRISPR / Cas9 والخلايا السلفية المكونة للدم الأولية باستخدام نهج البروتين النووي الريبي. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات تكون الدم الطبيعي والخبيث ، مثل ما هي العواقب الجزيئية والظاهرية لفقدان الجين X.الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سهلة للغاية وسريعة وفعالة من حيث التكلفة. الوقت المقدر اللازم من التجربة تصور إلى التنفيذ أقصر من أسبوع واحد.

على الرغم من أن هذه الطريقة قد تم تحسينها للخلايا السلفية المكونة للدم ، إلا أنه يمكن تطبيقها على أنواع الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا التائية الأولية والفئران وخطوط الخلايا المكونة للدم البشرية وعينات سرطان الدم الأولية. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أدركنا كيف أن مناهج توصيل CRISPR / Cas9 الأخرى ، بما في ذلك البلازميدات والفيروسات ، كانت إما سامة لخلايانا أو كانت أوقات استجابة بطيئة. من أجل تصميم الحمض النووي الريبي أحادي الدليل محل الاهتمام ، انتقل أولا إلى موقع CRISPRscan على الويب.

بناء على الخلية محل الاهتمام ، اضغط على زر الماوس أو الإنسان ثم أدخل الجين محل الاهتمام في مربع بحث UCSC وانقر فوق انتقال. بعد ذلك ، قم بتكبير exon الذي ترغب في استهدافه. تحقق مما إذا كانت أي تسلسلات مستهدفة للحمض النووي الريبي أحادية الدليل مدرجة ضمن تنبؤات CRISPRscan على عنوان الجينات.

بعد ذلك ، انقر فوق الحمض النووي الريبي أحادي الدليل المستهدف المسمى على أنه مستطيل أخضر وانسخ التسلسل الكامل المعروض تحت تسلسل Oligo. ثم الصق التسلسل في مستند نصي. بعد ذلك ، أضف النيوكليوتيدات ATAGC إلى الطرف الأولي الثلاثة للتسلسل.

ضع الأمر لتسلسل الطول الكامل. الآن ، لتجميع قالب الحمض النووي للحمض النووي الريبي أحادي التوجيه ، قم بإذابة ثم تخفيف البادئات العكسية للأمام والعالمية من الحمض النووي الريبي أحادي التوجيه. ثم أضف جميع الكواشف في أنبوب PCR لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل.

بعد تكوين تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ضع الأنبوب في جهاز تدوير حراري وقم بتشغيل البرنامج. بمجرد انتهاء البرنامج ، قم بتنقية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام أعمدة تنقية الحمض النووي. تمييع الحمض النووي في 11.5 ميكرولتر من محلول الشطف.

بعد ذلك ، استخدم المخزن المؤقت للشطف كفارغ على مقياس الطيف الضوئي. قم بقياس تركيز عينة الحمض النووي على مقياس الطيف الضوئي. أولا ، قم بخلط الحمض النووي الملوطف ، وفوسفات الديوكسي نوكليوتيد ، والمخزن المؤقت للتفاعل ، ومزيج إنزيم بوليميراز T7 RNA في أنابيب شريط PCR.

ثم احتضان العينة عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. بعد ذلك ، ضع عامل تنظيف RNase لإزالة RNase من القفازات المستخدمة. بعد ذلك ، اضبط حجم كل عينة من الحمض النووي الريبي إلى 50 ميكرولتر بماء خال من النوكلياز.

قم بتنقية الحمض النووي الريبي باتباع تعليمات الشركة المصنعة. أخيرا ، قم بتصفية الحمض النووي الريبي في 50 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز. أولا ، استخدم الماء الخالي من النوكلياز لإفراغ مقياس الطيف الضوئي ثم قياس تركيز الحمض النووي الريبي المملوء.

استخدم استبعاد الtrypan blue لحساب عدد الخلايا. لكل تكرار ، اجمع 200 ، 000 خلية قابلة للحياة لكل تكرار ، ثم أضف محلول ملحي مخزن بالفوسفات لغسل الخلايا. ثم قم بتدوير الأنبوب عند 300 مرة جم لمدة سبع دقائق.

بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية. أثناء الطرد المركزي ، احتضن 1.5 ميكروغرام من Cas9 مع ميكروغرام واحد من إجمالي الحمض النووي الريبي أحادي التوجيه في أنبوب PCR لمدة 20 إلى 30 دقيقة. هذا لإعداد مجمعات Cas9-sgRNA RNP لكل تكرار.

بعد حساب حجم المخزن المؤقت لإعادة التعليق T المطلوب ، قم بإذابة حبيبات الخلية التي تم الحصول عليها في المخزن المؤقت لإعادة التعليق T.ثم أضف 10 ميكرولتر من تعليق الخلية الذائبة في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل مع مجمعات Cas9-sgRNA RNP. بعد ذلك ، قم بتشغيل وحدة التثقيب الكهربائي. حرك الكوفيت في حامل الكوفيت.

ثم أضف ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت E.اضبط الشروط على جهاز التثقيب الكهربائي. لإجراء التثقيب الكهربائي، أمسك أولا ماصة التثقيب الكهربائي ثم مد المخلب وامسك بالقرص داخل طرف الماصة، ثم اضغط بقوة على الماصة لأسفل لتأمين الطرف. بعد ذلك ، امزج العينة عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل 10 مرات.

ارسم 10 ميكرولترات من العينة وتأكد من عدم وجود فقاعات هواء. بعد ذلك ، أدخل الطرف مباشرة في المخزن المؤقت الإلكتروليتي في كوفيت التثقيب الكهربائي. ثم اضغط على ابدأ على الشاشة.

دع الرسالة كاملة تظهر على الشاشة. ثم قم بإزالة الماصة من الكوفيت. بعد ذلك ، قم بتوزيع المحتويات من الكوفيت إلى البئر المملوء بوسط استزراع HSPC الجديد.

لدراسة فعالية التثقيب الكهربائي Cas9-sgRNA RNP ، يتم تزويد HSPCs المعزولة من الفئران بالكهرباء باستخدام RNase أحادي التوجيه يستهدف إما GFP أو tdTomato. عبرت HSPCs هذه في كل مكان عن GFP أو tdTomato. يظهر تحليل قياس التدفق الخلوي ما يقرب من 75 و 74٪ من فقدان تعبير GFP أو tdTomato في HSPCs على مستوى البروتين.

بعد ذلك ، يتم إجراء اختبار T7 endonuclease القائم على واحد باستخدام الحمض النووي المضخم PCR من موضع GFP للخلايا الكهربائية. هذا لتحديد كفاءة تعطيل الجينات ل GFP. يستخدم برنامج ImageJ لحساب نسبة شدة الشقوق إلى النطاقات غير المشقوقة لحساب النسبة المئوية للانقسام.

تم اختبار كفاءة ثلاثة RNAs أحادية التوجيه مختلفة تستهدف CD45 البشري في خط خلايا HL-60 AML. يظهر قياس التدفق الخلوي RNA1 أحادي التوجيه باعتباره الأكثر كفاءة بكفاءة 98٪ بالضربة القاضية عند مقارنته بعنصر التحكم. بعد ذلك ، يتم إجراء ضربة قاضية CD45 أيضا في دم الحبل السري البشري الأولي CD34 إيجابي HSPCs باستخدام RNA1 أحادي التوجيه.

يظهر تحليل قياس التدفق الخلوي ما يقرب من 80٪ من الخلايا مع فقدان CD45 مع عدم وجود تغيير في تعبير CD34 مقارنة ب Cas9 فقط. من أجل دراسة نقش الخلايا العصبية البشرية CD45 بالضربة القاضية ، يتم حصاد خلايا نخاع العظام والطحال من فئران NSG الإيجابية CD34 المنقولة بشكل رجعي للتحليل ، مما يدل على الخلايا المعدلة على أنها إيجابية HLA-ABC و CD45 سلبية. بمجرد إتقانه ، يمكن إكمال هذا البروتوكول في ثلاثة أيام ، إذا تم تصحيحه.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على جميع الأسطح والكواشف خالية من RNase ، والتحقق من اضطراب الجينات الفعال باستخدام تقنيات متعددة ، واستخدام الضوابط التجريبية المناسبة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم وتوليف ونقل البروتينات النووية الريبية Cas9-sgRNA إلى خلايا سلفية مكونة للدم للحصول على اضطراب جيني سريع وفعال.