مقايسة تدرج درجة الحرارة لتحديد تفضيلات الحرارية يرقات المورفولوجية

يمكن استخدام هذه الطريقة لمعالجة سؤال رئيسي في مجال التحسس الجسدي ، وهي الآلية التي يختار بها ، مثل ذبابة الفاكهة السوداء درجة الحرارة البيئية المفضلة لديه. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تحدد درجة الحرارة المفضلة لمجموعة اليرقات في اختبار واحد عند مواجهة مجموعة مستمرة من درجات الحرارة. بالإضافة إلى توفير نظرة ثاقبة لتفضيلات درجة حرارة ذبابة الفاكهة ، يمكن أيضا تكييف لوحة الإعجاب للاستخدام مع الكائنات الحية النموذجية الأخرى مثل الدودة ، C elegans.

أولا ، اصنع معجون الخميرة لتحضير قوارير للصليب. اخلطي حبيبات الخميرة في الماء المقطر وطحنها في عجينة باستخدام مدقة. بعد ذلك ، أضف القليل من معجون الخميرة بالقرب من الجدران الداخلية لقوارير ذبابة الفاكهة القياسية فوق سطح الطعام مباشرة.

لإنتاج اليرقات ، اجمع 12 إلى 35 أنثى وما يصل إلى نصف عدد الذكور ، ولكن ليس أكثر من 10 ذكور. امزج هذه المجموعات في قارورة تحتوي على عجينة الخميرة. قم بتحميل القوارير المحضرة في صينية مكونة من 100 قارورة.

قم بتضمين 20 قارورة مفتوحة محملة بالماء في الدرج لتوفير الرطوبة. ثم أغلق الدرج في كيس بلاستيكي شفاف واحتضنه عند 25 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. بعد 48 ساعة من التغذية والتزاوج ، انقل الذباب إلى قوارير طعام جديدة لجمع البيض.

اضغط عليها. لا تستخدم ثاني أكسيد الكربون. ثم اسمح للذباب بوضع البيض لمدة ثلاث ساعات عند 25 درجة مئوية.

في وقت لاحق ، قم بإزالة البالغين وضع القوارير التي تحتوي على البيض مرة أخرى في الصينية مع قوارير الماء وأغلق الكيس. ثم قم بتطوير البيض عند 25 درجة مئوية إلى مرحلة اليرقات المرغوبة. لإعداد تدرج اتجاهي واحد ، قم أولا بإنشاء بيئة محيطة بشرية للمقايس.

ضع كتلتين من الألومنيوم متصلتين بحمامات مائية منفصلة على مناشف ورقية مبللة ، على بعد 10 سم. يجب تسخين الحمامات المائية مسبقا. بعد ذلك ، اصنع 100 مل من 1٪ agarose وأضف 25 مل إلى كل لوحة فحص على سطح مستو.

بمجرد أن يصلب الاغاروز ، افركي السطح برفق بإسفنجة من الميلامين لجعل السطح خشنا قليلا. بعد ذلك ، لتعزيز نقل درجة الحرارة بكفاءة ، املأ أي فجوات بين كتل الألمنيوم في ألواح الفحص بالماء الذي يتم توصيله من زجاجة رذاذ. الآن ، ضع لوحات الفحص على كتل الألمنيوم وتأكد من أن الترسيم على بعد سنتيمترين من أي من الحواف لتتناسب تماما مع حواف كتل الألمنيوم.

بعد ذلك ، رش طبقة من الماء على سطح الألواح حتى لا تجف المواد الهلامية. بعد ذلك ، قم بتغطية النظام بصندوق من الورق المقوى لتقليل التبخر والمساعدة في استقرار درجة حرارة سطح الجل. انتظر لمدة خمس إلى 10 دقائق للسماح لدرجة الحرارة بالتوازن.

بعد ذلك ، تحقق من درجة حرارة السطح على اللوحة في 12 موقعا على الأقل للتأكد من وجود درجة حرارة متساوية طوال الوقت ، أعط أو خذ درجتين مئويتين. ثم استبدل غطاء الصندوق حتى يتم إجراء الفحص. لعزل اليرقات النظيفة ، أضف أولا حوالي 40 مل من محلول السكروز بنسبة 18٪ إلى أنبوب اختبار سعة 50 مل.

ثم انقل اليرقات من أكوام الطعام إلى المحلول باستخدام مغرفة. بعد ذلك ، اخلطي اليرقات في المحلول جيدا باستخدام المغرفة. الآن ، انتظر لمدة 30 إلى 60 ثانية حتى تطفو اليرقات على الطبقة العليا من الأنبوب.

ثم اسكب المحلول مع اليرقات في أنبوب آخر سعة 50 مليلتر وقم بتغطيته بالسكروز الطازج بنسبة 18٪. مرة أخرى ، انتظر حتى تطفو اليرقات. يمكن أن يؤثر وجود الطعام على النتائج.

لذلك ، من أجل الحصول على نتائج قابلة للتكرار ، من المهم تنظيف اليرقات جيدا لتقليل التلوث بالطعام. افعل ذلك برفق لتجنب تلف اليرقات. بعد ذلك ، ضع مصفاة خلية 300 ميكرون فوق أنبوب سعة 50 مليلتر ، ثم قم بإزالة أي جثث بالغة ميتة وحطام عائم من سطح محلول السكروز.

الآن ، اسكب اليرقات من خلال المصفاة لجمعها على الشاشة الشبكية. ثم قم بتشغيل حوالي 50 مل من الماء عبر المصفاة مرتين لتنظيف اليرقات بشكل أكبر. ثم ، في طبق فارغ 35 ملم ، اشطف معظم اليرقات من المصفاة باستخدام الماء.

استخدم فرشاة الرسم لنقل اليرقات المتبقية على الشبكة. بعد ذلك ، قم بسحب معظم الماء من الطبق باستخدام ماصة صغيرة. ثم ضع الغطاء على الطبق رأسا على عقب حتى لا تتمكن اليرقات من الهروب.

الآن ، اسمح لليرقات بالتعافي لمدة 10 إلى 20 دقيقة قبل بدء الفحص. أولا ، قم بإزالة صندوق الورق المقوى فوق الجل وتحقق بسرعة من درجة حرارة سطح الجل. إذا كان السطح جافا ، رش كمية صغيرة من الماء على السطح.

إذا كان الجل جيدا ، فقم بتحميل 100 إلى 200 يرقة في وسط كل لوحة ، باستخدام فرشاة رسم صغيرة. بعد ذلك ، ضع غطاءا فوق كل لوحة فحص لاحتجاز اليرقات وقم بتغطية الإعداد بصندوق من الورق المقوى لمنع التعرض للضوء. الاختبار قيد التنفيذ الآن.

بعد 10 إلى 30 دقيقة ، قم بإزالة صندوق الورق المقوى وغطاء الصفيحة الدقيقة. ثم قم بتصوير الصفائح من الأعلى لتسجيل موضع اليرقات. ضع الصندوق فوق الكاميرا لتجنب الانعكاس على سطح الجل.

لتنظيف اللوحة ، استنشق كل اليرقات أينما كانت متناثرة. الآن ، احسب النسبة المئوية لتوزيع اليرقات في كل منطقة ، باستخدام برنامج تحليل الصور. قم بعمل خطوط كل سنتيمترين ، بناء على الترسيم على لوحة الفحص واحسب عدد اليرقات في كل منطقة.

عند العد ، تجاهل اليرقات الموزعة في التلال 0.5 سم من كل حافة لأن سمك الهلام وظروف درجة الحرارة ليست موحدة بالقرب من الحافة. في 18 درجة مئوية إلى 28 درجة مئوية ، تم إجراء تدرج أحادي الاتجاه باستخدام حمامات مائية مضبوطة على 16.8 درجة مئوية و 31 درجة مئوية. تم العثور على توزيع درجة الحرارة على طول التدرج ليكون خطيا تقريبا.

تم فحص يرقات التحكم في مختلف الأعمار. أظهرت يرقات الطور الأول والثاني والثالث المبكر تفضيلات الذروة لمنطقة 24 درجة مئوية. خلال منتصف الطور الثالث ، تراكمت معظم اليرقات في منطقة 18 درجة مئوية.

تجمعت يرقات العصر الثالث غير المتجول بإحكام في منطقة 18 درجة مئوية. لم يكن الميل إلى التراكم في منطقة 18 درجة مئوية في سلالة التحكم ، والتي كانت بيضاء 1118 ، بسبب تأثير الحافة ، حيث أن يرقات الطور الثالث المتأخرة لا تزال تتراكم في منطقة 18 درجة مئوية ، باستخدام تدرج ثنائي الاتجاه. عندما قمنا بتحليل الطفرات التي تؤوي يرقات الطور الثالث المتأخرة المطلوبة لتمييز درجة الحرارة ، تغيرت النتائج.

اليرقات ذات الطفرة الفارغة في trpA1 موزعة بالتساوي على كامل التدرج من 18 درجة مئوية إلى 28 درجة مئوية. كما أظهرت اليرقات التي تفتقد الأشكال الإسوية A و B أو الأشكال الإسوية C و D ل trpA1 ضعف شديد. كما تعطلت اليرقات التي تحتوي على طفرة في أحد الجينات التي تشفر فوسفوليباز سي بيتا ، norpA.

ومع ذلك ، فإن اليرقات التي لديها طفرة في الجين الذي يشفر الفوسفوليباز ج بيتا الآخر ، plc21c ، تصرفت بشكل طبيعي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم واضح حول كيفية الحصول على نتائج قابلة للتكرار باستخدام تدرج حراري مستمر ، مما سيسمح لك بمقارنة تفضيلات درجة الحرارة للنوع البري ويرقات ذبابة الفاكهة الطافرة. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في 30 دقيقة لاختبار واحد.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم الانتباه إلى حالة قوارير الذباب وعدم استخدام اليرقات إذا جفت تعمل هذه التقنية على تبسيط اكتشاف الجينات الجديدة التي تتطلبها يرقات ذبابة الفاكهة لاختيار درجة الحرارة المفضلة لديها في النطاق المريح.