طريقة الأوتوراديوغرافية الكمية لتحديد المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين الدماغي في فيفو

تخليق البروتين هو عملية بيولوجية حاسمة للخلايا. في الدماغ، وهو مطلوب للتغيرات التكيفية. قياس معدلات تخليق البروتين في الدماغ سليمة يتطلب اعتبارات منهجية متأنية. هنا نقدم L-[1-¹⁴C]-leucine طريقة أوتوراديوغرافية كمية لتحديد المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين الدماغي في الجسم الحي.

قياس المعدلات الإقليمية لتخليق بروتين الدماغ يمكن تتبع استجابة الدماغ للتغيرات طويلة الأجل مثل التي تحدث أثناء التنمية والمرونة العصبية. لدينا طريقة لديها مزايا أن القياسات هي كمية تماما، وأنها مصنوعة في الحيوان يتصرف مستيقظا. تسمح تقنية التصوير التلقائي الكمي بإجراء قياسات في جميع مناطق الدماغ في وقت واحد.

ومن خلال هذا الإجراء، ستكون أنيتا توروسيان، زميلة ما بعد البكالوريا في مختبري، وتيانجيان هوانغ، جراح الحيوانات لدينا. ابدأ هذا الإجراء مع التحضير للجراحة كما هو مفصل في بروتوكول النص. مرة واحدة على مرحلة الجراحة، واستخدام مقص الجراحية لجعل شق سنتيمتر واحد من الجزء العلوي من منتصف الفخذ الأيسر مُجَرَّد نحو خط الوسط الكشف عن الشريان الفخذي والوريد.

سحب الجلد فضفاضة مع السنانير الجلدية الجراحية أعلاه وعلى جانبي الشق. تأمين السنانير الجلد عن طريق تسجيل لهم إلى مرحلة الجراحة. تطبيق معقمة 0.9٪ كلوريد الصوديوم إلى المنطقة المعرضة للحفاظ على الرطوبة الكافية.

استخدم ملقطًا لتشريحها، وفصل النسيج الضام حول قسم صغير من الشريان الفخذي والوريد. يفصل الشريان والوريد بعناية. الآن استخدام ملقط لخيط واحد من خياطة امتصاص تحت كل من الوريد الفخذ والشريان في النقطة الجانبية الأكثر من شق.

سحب خياطة في منتصف الطريق من خلال حتى نهايات حتى. عند نقطة أقرب إلى الفخذ ، استخدم ملقطًا لخيط خياطة ثانية تحت الوريد الفخذي فقط. ربط بلطف نصف عقدة التي سيتم استخدامها لتقييد تدفق الدم.

عند نقطة بين حبلا A وB حبلا، استخدم ملقط لخيط خياطة ثالثة تحت الوريد الفخذي فقط. ربط بلطف عقدة كاملة التي سيتم استخدامها لتقييد تدفق الدم. يجب الحرص على عدم تمزيق الوريد.

شد بلطف على حبلا B للحد من تدفق الدم. استخدام الهيموستات لسحب بلطف حبلا B للحفاظ على قيود الدم. الآن، قم بتوصيل نهاية غير قطع من أنابيب PE لإبرة قياس 32 وحقنة ملليمتر واحد مليئة المالحة heparinized.

قم بشطف القسطرة لإزالة فقاعات الهواء. قطع ثقب صغير في المنطقة المحظورة من الوريد الفخذي مع مقص صغير، وإدراج بعناية نهاية الزاوية من الأنابيب PE مسح ثمانية نحو حبلا B.Once إدراجها، وإطلاق التوتر حبلا B وتوجيه القسطرة مزيد من الوريد. شد حبلا B حول الوريد الذي يحتوي على القسطرة.

باستخدام حبلا C، ربط عقدة إضافية حول القسطرة. تأكد من أن هذه العقدة لا تلتقط الشريان الفخذي. اسحب بلطف إلى الخلف على برميل الحقنة لملء الأنابيب جزئياً بالدم لضمان زرع القسطرة بشكل صحيح قبل إدخال قسطرة PE 10 في الشريان الفخذي الأيسر باستخدام نفس الإجراء.

بمجرد تأمين كل من الوريد الفخذي والشريان القسطرة، وربطة عنق حبلا ألف في عقدة حول كل من القسطرة. بعد قطع جميع الغرز الزائدة وإزالة خطاطيف الجلد ، قم بشطف القسطرة الشريانية بالملح المهاوي لمنع التخثر. الكي طرفي كل من القسطرة لإنشاء ختم.

ضع الفأر في وضعية المعرضة و قم بعمل شق صغير في قاعدة الرقبة مع تطبيق المالحة على المنطقة المعرضة. أدخل قضيبًا معدنيًا مجوفًا تحت الجلد من شق الرقبة إلى شق الفخذ. ثعبان القسطرة من خلال قضيب جوفاء والخروج من شق الرقبة.

بعد إزالة قضيب جوفاء، إغلاق شق الفخذ مع خياطة تليها مسكن بعد الجراحة. ثعبان القسطرة من خلال أنبوب جوفاء مرنة 30 سنتيمترا لجعل حبل الربيع قبل خياطة زر الحبل الربيع تحت الجلد تليها مسكن ما بعد الجراحة. حرك الماوس إلى حاوية أسطوانية واضحة مع جبل دوار وذراع لإيواء الماوس خلال فترة النقاهة.

ضع يدًا أكثر دفئًا تحت الحاوية للحفاظ على دفء الماوس. تأكد من أن الماوس في حالة فسيولوجية طبيعية في بداية التجربة عن طريق أخذ عينات كما هو مفصل في بروتوكول النص. لإدارة التتبع عن طريق الوريد، استخدم موصل Y مع حقنة تحمل متتبع الليسين C 14 المسمى المتصل بذراع واحدة، وحقنة مع 100 إلى 200 ميكرولترات من المالحة العقيمة لطرد الخط الوريدي المتصل بالذراع الأخرى.

قم بتوصيل موصل Y بخط الوريد. بدء الدراسة عن طريق بدء في وقت واحد وقف ووتش، وحقن التتبع، وجمع عينات الدم الشرياني في الوقت المناسب. دافق الخط الوريدي مع المالحة مباشرة بعد الحقن.

جمع عينات الدم من واحد إلى سبعة بشكل مستمر طوال أول دقيقتين من التجربة بنفس الطريقة. بعد جمع العينات السبع، جمع 30 ميكرولترات من دم الفضاء الميت قبل كل عينة المتبقية. يتم جمع العينات من ثمانية إلى 14 في ثلاث دقائق، وخمس، و10، و15، و30، و45، و60 دقيقة على التوالي.

في مرحلة ما خلال التجربة، معالجة ثلاثة أنابيب للمعايير الداخلية التي تحتوي على الكروسين التريتيد والورولوسين كما هو مفصل في بروتوكول النص. لتحديد تركيزات الليوسين البلازما، استخدم نظام HPLC مع عمود تبادل الموجبة للصوديوم والعمود آخر اشتقاق مع orthophthalaldehyde والكشف الدقيق. المنطقة تحت منحنى الليسين يتناسب مع تركيز الليسين في العينة.

استخدم المقارنة مع المعايير لقياس تركيزات اللوسين في العينات. ثم استخدام عداد التلألؤ السائل لتحديد التحلل في الدقيقة من التريتيوم و C 14 في عينات البلازما. استخدم هذه التركيزات لبناء منحنى إزالة الليسين C 14 المسمى من الدورة الدموية والدور الزمني لنشاطها المحدد في البلازما الشريانية.

من الرسم البياني، حساب C 14 المتكاملة المسمى نشاط معين leucine في البلازما الشريانية. لإجراء التصوير الذاتي الكمي، إعداد أقسام الدماغ 20 ميكرون في سمك. قسم الدماغ عن طريق التبريد في ناقص 20 درجة مئوية.

ذوبان مقاطع جبل على شرائح الجيلاتين المغلفة. بعد تثبيت الشرائح، وترتيب الشرائح في شريط كاسيت فيلم الأشعة السينية جنبا إلى جنب مع مجموعة من معايرة سابقا C 14 المسمى ميثيل methacrylate المعايير. في غرفة مظلمة وتحت ضوء آمن، وضع قطعة من فيلم الأشعة السينية، مستحلب الجانب إلى أسفل على الجانبين والمعايير.

ختم الكاسيت ووضعها في حقيبة تغيير السوداء. تطوير الأفلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لا ينصح بتطوير الفيلم الآلي لأن الخلفية قد تكون غير متساوية ويمكن أن تؤثر على القياس الكمي.

بناء منحنى معايرة من الكثافة البصرية مقابل تركيز الأنسجة C 14 على أساس قيم الكثافة البصرية لمجموعة من المعايير معايرة على الفيلم. اُدمج هذه البيانات في معادلة متعددة الحدود. إما أن تكون معادلة متعددة الحدود من الدرجة الثانية أو الثالثة تناسبها بشكل جيد جداً.

لتحليل مناطق معينة من الدماغ، حدد موقع المنطقة التي تهمك أو ROI في ستة إلى ثمانية أقسام بالمقارنة مع أطلس الدماغ. سجل الكثافة البصرية للبكسل داخل عائد الاستثمار في جميع الأقسام. استنادًا إلى منحنى المعايرة، احسب تركيز الأنسجة C 14 في كل بكسل.

وأخيرا، حساب المعدلات الإقليمية من تخليق البروتين الدماغي من متوسط تركيز C 14 الأنسجة في العائد على الاستثمار في المتكاملة نسب تركيزات البلازما الشريانية من لوسيين غير المسمى وتسمى في بعض الأحيان t و لامبا. جزء من الليسين في بركة السلائف الأنسجة التي تأتي من البلازما. تظهر هنا صور تمثيلية من تعامل معه مركبة مقارنة مع عولج بـ أنيسومايسين، وهو مثبط لتوليف البروتين.

معدلات تخليق البروتين متناسبة مع مستوى الظلام في الصورة. الأنيسيومايسين يقلل بشكل كبير من المعدلات المقاسة من تخليق بروتين الدماغ مما يدل على خصوصية هذه الطريقة. هنا، تظهر الصور التلقائية الرقمية من فأر مستيقظ يتصرف على مستوى قرن آمون وتحت المهاد.

المناطق الأكثر قتامة لديها معدلات أعلى الإقليمية من تخليق البروتين الدماغي. يظهر هنا هو autoradiogram رقمية من ماوس التحكم في التصرف مستيقظا على مستوى الحصين الظهرية. معدلات تخليق البروتين الدماغي هي اللون المغلفة في الصور وفقا لشريط اللون.

أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم التأكد من أن الحيوانات في حالة فسيولوجية طبيعية أثناء القياسات. وقد أظهرت منهجيتنا بالفعل إلغاء تنظيم تخليق البروتين في الاضطرابات العصبية مثل متلازمة X الهشة. قد يكون أيضا علامة مفيدة للتغيرات التنكسية والظروف مثل مرض الزهايمر.

ويمكن استخدام طريقة تخليق البروتين بالاقتران مع هستووتشيستريا المناعة في أقسام بالتناوب لربط التغيرات في تخليق البروتينات مع التغيرات الإقليمية في بروتينات محددة. وباختصار، فإن طريقة الغرافيك التلقائية الكمية L-1 C 14 leucine مثالية لتحديد المعدلات الإقليمية لتوليف البروتين في الجسم الحي. وهو يوفر مزايا كبيرة من حيث الدقة ومدى انطباقها على الظروف في الجسم الحي.