النظام القائم على microinjection لفي غرس فيفو Cardiomyocytes الجنينية في جنين الطيور

يساعدنا هذا البروتوكول على تحديد كيفية تأثير التعديلات في الميكانيكا الحيوية المحلية، وهندسة الأنسجة، وبيئات الأشباه و التفاعلات الهيكستاكرين على النمط الظاهري الخلوي. هذه التقنية تسمح لنا لاستكشاف النماذج الكلاسيكية وعلم الأجنة التجريبية دون التسبب في إهانات الأنسجة على نطاق واسع التي تنشأ عادة في تجارب الرسوم البيانية التقليدية. للعثور على الضغط المناسب للحقن، من المفيد البدء بضغط حقن أقل وزيادة تدريجياً حتى يتحقق تدفق مستمر للخلايا.

إن تصور هذه التقنية يساعد في تحقيق فهم مباشر لكيفية وضع معدات الحقن في موضعها بالنسبة للأنسجة المستهدفة. (إثبات الإجراء سيكون عضوين من مختبري (تريفور هينلي و(كانداس توماس قبل 24 ساعة من الزرع، سحب الشعيرات الدموية الزجاجية على سحب ميكرويبيت وفقا للبروتوكولات القياسية وتراجع الشعيرات الدموية في وكيل السيليكون لمعطف الأسطح الخارجية للإبر.

المقبل، تحميل 5 إلى 10 ميكرولترات من وكيل السيليكون في تلميح ماصة الحقن المجهري ووضع الطرف في نهاية واسعة من واحد المغلفة خارجيا سحب الشعرية الزجاجية. ضع طرف الماصات على مقربة من طرف إبرة الزجاج قدر الإمكان وإخراج عامل السيليكون مع سحب ماصة التحميل ببطء لتقليل فقاعات الهواء داخل الإبرة. اترك وكيل السيليكون في الإبرة الزجاجية لمدة 10 دقائق قبل استخدام ماصة تحميل جديدة لpirateate الحل.

ثم جفف الإبر في غطاء الدخان بين عشية وضحاها. لإعداد الجنين المضيف، احتضان بيض الدجاج الخصبة في اتجاه أفقي في حاضنة مرطبة عند 38 درجة مئوية واستخدام ملقط الزاوية لجعل ثقب قطره أكبر من ملليمتر واحد في الجزء السفلي من نهاية شقة كل بيضة على طول خط الاستواء البيض. أدخل إبرة قياس 18 تعلق على حقنة 10 ملليلتر في الثقب لإزالة حوالي خمسة ملليلترات من الألبومين.

وتطبيق شريط شفاف على الجزء العلوي من قذيفة البيض. تسجيل المنطقة اسجل على طول الجزء العلوي من البيض مع ملقط الزاوية واستخدام مقص تينوتومي المنحني لقطع ما يقرب من 2.5 سنتيمتر نافذة في القسم المسجل من البيضة. فحص الجنين ومرحلة على أساس المعايير التي وضعتها همبرغر وهاملتون واستخدام حقنة ملليمتر واحد مجهزة بإبرة قياس 32 لحقن حوالي 200 ميكرولترات من واحد إلى خمسة تخفيف الحبر الهند في HBSS تحت الجنين.

ثم ختم ثقب مع شريط شفاف وإضافة ملليلتر واحد من HBSS قطرة الحكمة على القرص الجنيني قبل ختم قذيفة نافذة مع فيلم البارافين لوضع البيض مرة أخرى في حاضنة مرطب. عندما تصل الأجنة إلى المرحلة 19 من هامبرغر وهاميلتون، شطف الشعيرات الدموية الزجاجية المغلفة بالسيليكون بالماء غير المتين والسماح للرايات الدموية بالجفاف لمدة ثلاث إلى أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة. في الوقت نفسه، نقل الجنين من بيضة واحدة إلى 100 في 15 ملليمتر طبق بيتري تحتوي على درجة حرارة الغرفة معقمة HBSS ووضع الطبق تحت مجهر ستيريو.

باستخدام ملقط، مقص تينوتومي وملعقة صغيرة، عزل القلب الجنيني بأكمله من الجنين وعزل الأذين من القلب. ضع النسيج الأذيني في أنبوب معقم 1.5 ملليلتر ميكروcentuge يحتوي على ملليلتر واحد من HBSS على الجليد. عندما تم جمع جميع الأنسجة المانحة، بيليه الأنسجة عن طريق الطرد المركزي في الزاوية الدقيقة الثابتةrifuge.

بالنسبة لهضم الأنسجة المانحة، أعد تعليق الكريات في ملليلتر واحد من 05٪ التربسين EDTA مسبقًا لاحتضان لمدة 15 دقيقة في كتلة حرارة مهزوزة بمعدل 300 دوران في الدقيقة. في نهاية الحضانة، ماصة حل الهضم عدة مرات لتفريق أي الأنسجة المتبقية و بيليه القلب lysate عن طريق الطرد المركزي. إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من محلول تحييد التربسين للطرد المركزي آخر تليها إعادة تعليق في 400 ميكرولترات من محلول صبغة الفلورسنت الحمراء.

بعد 20 دقيقة في 37 درجة مئوية، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة واحد إلى ثلاثة يغسل في ملليلتر واحد من HBSS لكل غسل. ثم إعادة تعليق الخلايا المسماة في خمس مرات عشرة إلى الخلايا الرابعة لكل تركيز ميكرولتر في HBSS جديدة. لفي حقن الحى من الخلايا المانحة، backload تعليق الخلية في الجافة، سيليكون المعالجة ماصة الشعيرات الدموية كما هو موضح وجبل ماصة في جهاز ضغط الحقن الدقيق.

نقل كل جنين المضيف ليتم حقنها من حاضنة مرطب إلى حامل بيضة تحت المجهر ستيريو الفلورسنت تشريح. واستخدام ملقط غرامة عقيمة لفتح غشاء vitelline. جعل شق 5 إلى 1 ملليمتر في pericardium ووضع microinjecter بحيث غيض من إبرة الحقن المجهري تخترق الأنسجة المستهدفة.

تعيين ناخنة صغيرة لتطبيق نبضات واحدة من 5 ثوان في المدة وتتراوح بين 100 إلى 400 hectopascals في الضغط. والضغط حقن الخلايا. من المهم التحقق من نجاح زرع الخلايا عن طريق تصوير إشارة الفلورسنت قبل إعادة صم البيض.

ويمكن أيضا أن يتم تصوير الجنين لتوثيق هذا الإجراء. عندما تم حقن جميع الخلايا، تراجع جهاز الحقن المجهري وإزالة البيض من حامل. ثم إضافة ملليلتر واحد من HBSS الدافئة قطرة الحكمة على الجنين.

ختم البيضة مع شريط التعبئة الشفافة والعودة البيض إلى حاضنة مرطب لمدة 24 ساعة بعد زرع. هنا ، يظهر القلب والأنسجة المحيطة بها من القلب الجنينية المضيف بعد زرع الغدد الصماء الأذينية المانحة. في هذه التجربة التمثيلية ، تم تحويل الخلايا المانحة إلى proepicardium من جنين مضيف في مرحلة مماثلة.

وكشف المقطع البصري باستخدام المجهر confocal أن الخلايا الإيجابية الوحيدة عضلة القلب علامة داخل proepicardium كانت الخلايا الإيجابية الفلورية المزروعة بشكل محوري. الحرص على عدم الإفراط في التلاعب الجنين المتلقي كما تمزقات في القلب والأوعية الدموية المحلية الناجمة عن إبرة الحقن يمكن أن يؤدي إلى انخفاض القدرة على البقاء. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء مجموعة متنوعة من المقايسات المصب، بما في ذلك الكيمياء المناعية، والتهجين في الموقع وفرز الخلايا.

وكيل السيليكون هو قابل للاشتعال للغاية وسامة للغاية. وينبغي أن يكون دائما التعامل مع الرعاية ومعدات الحماية الشخصية المناسبة داخل غطاء محرك الدخان.