مراقبة ديناميكيات تفاعل البروتين والحمض النووي الريبي في الجسم الحي بدقة زمنية عالية باستخدام χCRAC

يمكن استخدام CRAC الحركي لدراسة الارتباطات الزمنية بين بروتينات ربط الحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي على نطاق زمني قصير غير مسبوق. عند دمجها مع الرابط المتقاطع الخاص بنا ، فإن CRAC الحركية قادرة على ربط الخلايا الحية في غضون ثوان. هذا يقلل من استجابات أضرار الأشعة فوق البنفسجية ويسهل دراسة استجابات الإجهاد بدقة دقيقة.

Kinetic CRAC هو بروتوكول طويل جدا يمكن أن يمثل تحديا للمستخدمين الجدد. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العمل مع الحمض النووي الريبي يطرح تحدياته الخاصة. لمنع تدهور الحمض النووي الريبي، يجب على المرء تصفية وتعقيم جميع المحاليل والتأكد من الحفاظ على نظافة الماصات ومقعد المختبر.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن بعض الخطوات ليست بديهية للغاية. وهذا يشمل التشابك بالأشعة فوق البنفسجية وحصاد الخلايا ، بالإضافة إلى استخراج الحمض النووي الريبي المتشابك من الجل. لإجراء تشابك الأشعة فوق البنفسجية على الكائنات الحية الدقيقة في المحلول ، قم بتلقيح 3.5 لتر من الوسط المطلوب بالخميرة إلى OD 600 يبدأ من 0.05 ، وقم بتنمية الثقافة بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز المستمر عند 180 دورة في الدقيقة.

بمجرد أن تصل الخلايا إلى OD المطلوب ، اسكب 500 مل من المزرعة مباشرة في الرابط المتقاطع Vari-X-linker وقم بإشعاعها ب 250 مللي جول من الأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر. بعد التشابك ، استخدم جهاز ترشيح فراغي لتصفية الخلايا. قم بلف الغشاء بالخلايا المفلترة ، وضعه في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر يسمى T0. قم بتصفية الخلايا المتبقية على ستة مرشحات مختلفة ، وقم بإسقاط الأغشية في ثلاثة لترات من الوسط المسبب للإجهاد ، واخلطها بقوة باستخدام ماصة لمدة 50 ثانية. استمر في تشابك الخلايا بأحجام 500 مليلتر في النقاط الزمنية المطلوبة ، وقم بتخزين العينات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

لربط الخلايا الملتصقة ، انقل طبق ثقافة الكوارتز مع الخلايا إلى الدرج المتخصص ، وقم بإشعاعه ب 300 مللي جول من الأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر. ضع الطبق على الفور على الثلج. قم بإزالة وسط النمو من الطبق ، وأضف 10 مل من PBS المثلج. اجمع الخلايا عن طريق الكشط ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.

ثم قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 300 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد غسل الخلايا باستخدام PBS ، قم بإزالة PBS وقم بتجميد حبيبات الخلية على الثلج الجاف. قم بتخزين العينة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حسب الحاجة.

اضبط جهاز الطرد المركزي على أربع درجات مئوية ، وقم بإعداد صفين من أنابيب سعة 1.5 ملليلتر لكل عينة للشطف. قم بتدوير الأعمدة بسرعة باستخدام حبات النيكل للتخلص من حجم الفراغ. ثم ضع الأعمدة في الصف الأول من أنابيب الشطف ، واملأها ب 200 ميكرولتر من محلول الشطف.

بعد دقيقتين ، قم بتدوير الأعمدة بسرعة ونقلها إلى الصف الثاني من الأنابيب. ثم كرر الشطف كما هو موضح سابقا. عند الانتهاء ، امزج جميع المواد المشطة في أنبوب سعة خمسة ملليلتر ، وأضف ميكرولترين من 20 ملليغرام لكل مليلتر من الجليكوجين.

ثم أضف 100 ميكرولتر من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك إلى العينة ، وقم بدوامها لمدة 30 ثانية. بعد غسل العينة بالأسيتون ، أعد تعليقها في 30 ميكرولتر من محلول تحميل البروتين. ثم تحقق من النشاط الإشعاعي باستخدام عداد جيجر.

سخني العينة لمدة 10 دقائق عند 65 درجة مئوية ، وقم بتحميلها على هلام Bis-Tris مسبق الصب بمقدار أربعة إلى 12٪ مليمتر واحد. قم بتشغيل الجل لمدة 90 دقيقة عند 125 فولت في مخزن MOPS. عند الانتهاء ، لف الجل في غلاف بلاستيكي ، وثبته داخل شريط ضيق خفيف بشريط لاصق.

بعد تعريض الجل للفيلم الشعاعي التلقائي ، قم بتطوير الفيلم عن طريق قطع غلاف التشبث الذي يغطي الجل ، مع التأكد من عدم تحريك الجل وتعويض الصورة. ضع الفيلم فوق الجل ، واستخرج شريط الاهتمام. ضع شريحة الجل في أنبوب سعة ملليلترين ، واسحقها بطرف ماصة P1000.

ثم أضف البروتيناز K المخزن المؤقت والبروتيناز K.احتضان العينة عند 55 درجة مئوية مع الرج القوي. قم بتشغيل (كدنا) على هلام مسبقة الصب 6٪ TBE عند 100 فولت لمدة ساعة واحدة ، باستخدام سلم مناسب لقياس شظايا الحمض النووي القصيرة. عند الانتهاء ، ضع الجل في وعاء محكم الغلق مع ما يكفي من TBE لتغطيته ، وأضف كمية مناسبة من صبغة SYBR الآمنة.

وصمة عار الجل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم استبدل المخزن المؤقت المحتوي على SYBR ب TBE جديد. اغسل الجل لمدة 10 دقائق مع رج لطيف.

صفي TBE ، وضعي الجل في مجلد شفاف. قص المجلد إلى الحجم المناسب ، وقم بتصوير الجل بكمية الصورة. استئصال شظايا الحمض النووي بين 175 و 400 زوج أساسي ، وضع قطعة الهلام في أنبوب 1.5 ملليلتر.

سحق الجل بطرف ماصة P1000 ، وأضف 400 ميكرولتر من الماء. ثم احتضانه لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية أثناء الرج. جمد العينة على الثلج الجاف لمدة 10 دقائق.

ثم كرر الحضانة عند 37 درجة مئوية. أدخل مرشحين من الألياف الدقيقة الزجاجية داخل عمود مرشح يوضع في أنبوب. بعد ذلك، استخدم طرف ماصة P1000 المقطوع لنقل تعليق هلام TBE إلى وحدة الفلتر وتدويرها عند 17,000 جم لمدة 30 ثانية.

تم استخدام هذا البروتوكول لمراقبة تفاعلات Nrd1-RNA في خلايا الخميرة المعرضة لبيئة جائعة للجلوكوز. تم ربط العينات قبل التحول إلى الوسط بدون جلوكوز ، وكذلك بعد واحدة واثنتين وأربعة وثمانية و14 و 20 دقيقة. أظهرت الصور الشعاعية من التجربة إشارة مكثفة عند الوزن الجزيئي المتوقع ل Nrd1 ، والتي تمثل البروتين المرتبط بالحمض النووي الريبي الراديوي القصير غير القابل للتسلسل.

تم عزل الإشارة الموجودة فوق هذا النطاق ، وهو البروتين المرتبط بشظايا الحمض النووي الريبي الأطول. لتعديل بروتوكول CRAC الحركي لخلايا الثدييات ، تم تطوير مرحلة خاصة للسماح بالأشعة فوق البنفسجية للأطباق ذات الخلايا الملتصقة. تم قياس كفاءة هذا الإعداد من خلال التشابك والتقاط GFP RBM7 الذي تم وضع علامة عليه بشكل ثابت.

كان الرابط المتقاطع قادرا على استعادة مجمعات الحمض النووي الريبي البروتيني من خلايا الثدييات باستخدام تشعيع الأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر بكفاءات مماثلة لجهاز الأشعة فوق البنفسجية المستخدم على نطاق واسع. أدى تطوير طبق كوارتز بتري منفذ للأشعة فوق البنفسجية أثناء التشابك إلى تعزيز استعادة مجمعات الحمض النووي الريبي البروتيني. تظهر بيانات Nrd1 أن البروتين يرتبط بالعديد من نصوص الحمض النووي الريبي غير المشفرة ، مما يشير إلى أنه متورط في تدهور هذه النصوص.

تم إثبات الارتباط بالنصوص التي تشفر HXT6 و HXT7 ، وكلاهما يتم تنظيمه أثناء تجويع الجلوكوز. يسمح CRAC الحركي للمرء بقياس التفاعلات الديناميكية بين الحمض النووي الريبي البروتيني أثناء نمو الخلية ، واستجابات الإجهاد ، وتجميع المجمعات الجزيئية الكبيرة ، مثل الريبوسوم أو الجسيم.