بروتوكول للكيمياء النسيجية المناعية وتوزيع الحمض النووي الريبي في الموقع داخل جنين ذبابة الفاكهة المبكر

ككائن حي مع فترة حمل قصيرة ، فإن أجنة ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر هي مواضيع الدراسة الرئيسية للتحقيق في توزيع وتوطين البروتينات ومنظميها أثناء التطور. ومع ذلك ، بسبب أجنة غنية بالدهون وكوريون غني بالكيتين ، فإن فائدتها محدودة بسبب صعوبة تركيب الأجنة على الأسطح الزجاجية. في هذا العمل ، نقدم طريقة عملية تعزز بشكل كبير من ارتباط جنين ذبابة الفاكهة بالشرائح وتفصل طرقنا للكيمياء النسيجية الناجحة والكيمياء النسيجية المناعية والتهجين في الموقع.

قبل الخطوات الموضحة هنا ، يجب غسل الشرائح بالمنظفات ، ثم شطفها بماء الصنبور والماء المقطر قبل وضعها في الفرن حتى تجف. يجب أن تنقع الشرائح الجافة بلطف في ثنائي كرومات البوتاسيوم لمدة 24 ساعة قبل شطفها وتجفيفها مرة أخرى ، ثم توضع في 95٪ من الإيثانول لمدة ساعتين على الأقل. خلال هذه الخطوة ، يمكنك إعداد المزيد من الشرائح أو الجيلاتين الشب الكروم وفقا لأساليبنا.

يمكن بعد ذلك تخزين الجيلاتين في ماء حمام 60 درجة قبل الاستخدام. لطلاء الشرائح ، قم بإسقاط كمية صغيرة من الجيلاتين على حافة واحدة من الشريحة. ثم استخدم شريحة زجاجية أخرى لسحب الجيلاتين ببطء وبشكل متساو عبر سطح الشريحة ليتم طلاؤها.

هذا يخلق طبقة رقيقة ومتساوية. قبل وضعها في رف أو جهاز تجفيف ليتم تخزينها في فرن للسماح بالتجفيف الكامل لمدة ليلة أخرى أو 48 ساعة. يتم جمع الجنين باستخدام طبق أجار عصير العنب ، بمجرد أن يصبح جاهزا ، يمكن بعد ذلك إزالة لوحة أجار عصير العنب.

قم بإغراق اللوحة ب PBS وقم بتنظيفها برفق بفرشاة ناعمة لإزالة أي أجنة مرفقة. قم بإزالة الجنين الذي يحتوي على PBS إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر واتركه يستريح على الجليد. بمجرد استقرار الجنين على الجليد ، قم بإزالة PBS الفائق بلطف.

احرص على عدم إزعاج الجنين في أسفل الأنبوب. أضف 1 مل من المبيض بنسبة 50٪ إلى العينة ورجها بلطف لمدة دقيقتين. إزالة التبييض عن طريق الترشيح وغسل الأجنة في PBS ثلاث مرات.

تحضير ن الهيبتان. بمجرد أن تصبح جاهزة ، اغسل الأجنة من ورقة الترشيح إلى n-heptane عن طريق هز ورقة الترشيح بلطف في المحلول. اسمح للأجنة بالاستقرار في الجزء السفلي من صفيحة n-heptane وجمع هذا n-heptane في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 ملليلتر.

أضف ملليلتر واحد من الميثانول إلى الأنبوب ، واسمح للمحلول بالترسب ثم استطلع الميثانول n-heptane. اغسل الجنين في PBS ثلاث إلى خمس مرات لإزالة الميثانول المتبقي. قم بإزالة PBS الإضافي هذا وأضف مثبت Bouin واتركه يستقر لمدة 30 إلى 60 دقيقة من أجل إصلاح الأجنة.

قم بإزالة مثبت بوين واغسل الأجنة مرة أخرى في PBS ثلاث مرات. تحضير 1.2٪ من الأغاروز في PBS والحفاظ على الدفء في حمام مائي 60 درجة ثم إعداد الأجنة للتضمين عن طريق شفط PBS إضافية بلطف التي تم تخزينها فيها. احرص على عدم إزعاج الأجنة في القاع ، ثم قم بشفط قابس الجنين في الجزء السفلي من المحلول وضعه بلطف في قالب غطاء الزجاجة.

استطلع أي PBS إضافي من هذا القالب قبل إضافة 1.2٪ هلام الأغاروز. قم بإعداد حل PBS من أجل تخزين مقابس الأغاروز هذه. بمجرد تصلب الأغاروز ، يمكن بعد ذلك نقل المقابس الفردية إلى PBS هذا للتخزين.

هنا نعرض عملية الجفاف المتتابعة. السماح ب 15 دقيقة للحضانة في كل مرة. ثم قم بإزالته من الإيثانول بنسبة 100٪ وقم بإصلاحه في محلول واحد إلى واحد من الإيثانول والزيلين لمدة 15 دقيقة أخرى.

بمجرد إزالته من هذا الحل الفردي ، قم بإزالته في الزيلين النقي لمدة دقيقة واحدة. الآن عينة الأنسجة جاهزة للنقل إلى محلول بارافين زيلين دافئ واحد إلى واحد. اتركيه لمدة 30 دقيقة قبل التضمين النهائي في البارافين بنسبة 100٪.

انتقل إلى أول بارافين 100٪ والراحة لمدة ساعتين. كرر هذه العملية في اثنين وثلاثة بارافينات. العينة جاهزة الآن لنقلها إلى قالب والقالب مملوء بالشمع لإكمال عملية التضمين.

تضمين أجنة ذبابة الفاكهة. ضع أقسام البارافين المحضرة من أجنة ذبابة الفاكهة في فرن 60 درجة لمدة 15 دقيقة. ضعها في محلول 100٪ من الزيلين.

ثم نبدأ الإماهة. ضع الشرائح في كل من هذه الحلول لمدة ثلاث دقائق لكل منها. بمجرد أن تكون الشريحة في الماء المقطر ، ضعها في محلول الهيماتوكسيلين لمدة دقيقتين.

بمجرد الانتهاء ، تأكد من تصريف أكبر قدر ممكن من المحلول من الشريحة. بمجرد غسل الشريحة في الماء المقطر ، قم بتلطيخ الشريحة في الإيوسين لمدة دقيقة واحدة. أخيرا ، قم بإزالة الشريحة من الإيوسين واغسلها بالماء المقطر.

بمجرد أن تصبح هذه الشريحة نظيفة ، نبدأ الآن عملية الجفاف النهائية. وأخيرا يتم وضعها في 100٪ زيلين لمدة خمس دقائق. تتكرر هذه العملية في محللين جديدين من الزيلين بنسبة 100٪ وإسقاط كمية صغيرة من اللثة المحايدة على طول حافة واحدة من الشريحة.

خذ هذا الغطاء ووضعه برفق على حافة واحدة من الشريحة. أولا deparaffinize الشرائح عن طريق وضع في 100 ٪ زيلين. بمجرد إزالة الشرائح من الماء المقطر ، يجب تغطيتها بمحلول حمضي دوري بنسبة 1٪.

ثم نتخلص من المحلول الزائد ونشطف في الماء المقطر. عن طريق وضع الشريحة مباشرة في محلول مسخن مسبقا. بمجرد اكتمال ذلك ، نقوم بشطف الشريحة في الماء المقطر ثم نصبغ المحلول بكلوريد الذهب بنسبة 0.2٪ لمدة دقيقة إلى دقيقتين.

بعد ذلك ، نقوم بإصلاح الأنسجة بكبريتات ثيو الصوديوم بنسبة 3٪ لمدة ثلاث دقائق باستخدام الماء المقطر. ثم مضاد للوصمة مع الهيماتوكسيلين. بعد التلطيخ المضاد ، يمكن غسل البقعة بأي أنبوب من الماء المقطر كما هو موضح هنا.

ثم ننتقل إلى عملية الجفاف. اتبع ذلك عن طريق وضع الشرائح مباشرة في 100٪ زيلين ثم ضع كمية صغيرة من اللثة المحايدة على زاوية الشريحة. يغطى بلطف بقطعة غطاء.

ابدأ في إعداد الشرائح كما كان في السابق عن طريق إزالة البارافينات والزيلين. ثم في الإيثانول الزيلين واحد إلى واحد. بمجرد إزالة الشرائح ، نبدأ في إعادة ترطيب أنسجتها ثم أخيرا في PBS.

ضع الشرائح في 0.3٪ بيروكسيد الهيدروجين المصنوع في الميثانول لمدة 10 دقائق. ثم يتم تغطية الشرائح ب 20 مل من حل استرجاع الهدف. يمكن بعد ذلك وضع الشرائح في صندوق التلوين.

ضع صندوق التلطيخ في باخرة ، مما يضمن عدم هروب أي حل ولا تزال الشرائح مغطاة بالكامل. لاحظ أنه لا ينبغي إغلاق غطاء صندوق البقع بالكامل حتى يتمكن بخار الماء من الهروب أثناء عملية التبخير. ثم شطف بلطف في PBS-T ثلاث مرات.

تخلص من الحل الزائد وكرر العملية ، هذه المرة مع PBS. بعد ذلك ، نقوم باحتضان الشرائح في كتلة بيروكسيد لمدة خمس إلى 10 دقائق ثم شطفها عدة مرات مرة أخرى في PBS-T ثم في PBS. تحضير الجسم المضاد وقطرة مباشرة على الأنسجة.

يمكن بعد ذلك احتضان هذه الأنسجة أو في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات. يجب تحضين الجسم المضاد الثانوي في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة ، وهو تلطيخ بنسبة 5٪ DAB لمدة دقيقتين إلى 10 دقائق. بعد الحصول على اللون المناسب ، اشطف في الماء المقطر ، ثم قم بعكس الهيماتوكسيلين.

بعد هذه البقعة الهيماتوكسيلين ، يمكن بعد ذلك تجفيف الشرائح بالتتابع. ضع الشرائح في زيلين 100٪ واتركها تنقع لمدة ثلاث دقائق. ثم قم بإسقاط كميات صغيرة من اللثة المحايدة على حافة واحدة من الشريحة.

بمجرد وضع اللثة ، خذ غطاء الشريحة وضعه بلطف من حافة واحدة من الشريحة. أضف ميكروغرام واحد من الحمض النووي الخطي المنقى إلى قارورة تفاعل معقمة خالية من RNase. ثم أضف ما يكفي من الماء المقطر المزدوج المعقم الخالي من RNase من DEPC لجعل حجم العينة الإجمالي 13 ميكرولتر.

ثم جهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة واحتضان لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. بالنسبة لتجارب حماية RNase ، نوصي باحتضان لمدة 15 دقيقة باستخدام ميكرولترين من Dnase-1 ، خالية من RNase لإزالة الحمض النووي للقالب. بمجرد اكتمال خطوة الحضانة ، أوقف التفاعل بإضافة ميكرولترين من 0.2 مولار EDTA عند درجة الحموضة من ثمانية.

قبل الخطوات الموضحة هنا ، تم إزالة الشرائح وترطيبها ، وفقا لبروتوكولنا الموضح سابقا. بعد الإماهة ، احتضن الشرائح في 0.01 مول لكل لتر PBS عند درجة حموضة 7.4 لمدة خمس دقائق لكل منها لإزالة المحلول المثبت من الأنسجة. بعد الشطف في PBS ، نقوم بعد ذلك بالشطف باستخدام محلول جليسين 100 ملليمول لكل لتر لمدة خمس دقائق مرتين لإزالة مجموعات الألدهيد الحرة من الأنسجة.

بعد هذه الخطوة ، اشطف الشرائح باستخدام PBS لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، احتضن في PBS يحتوي على 0.3٪ triton X-100 لمدة 15 دقيقة قبل الشطف ثم احتضان مرة أخرى مع ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر من بروتين K.Next ، إصلاح الشرائح مع 4٪ paraformaldehyde و PBS عند درجة الحموضة 7.2 لمدة ثلاث دقائق. ثم ، اغسل الشرائح قبل احتضانها باستخدام 0.1 درجة حموضة عازلة من ثلاثي إيثانولامين المولي 8 ، تحتوي على 0.25٪ من أنهيدريد الخليك.

يمكنك اختيار إمالة الصندوق في هذه المرحلة لضمان التغطية الكاملة بالحل. يتم تحضير الصندوق عن طريق إضافة 20٪ من الجلسرين أو ماء DEPC إلى أسفل صندوق التهجين الجاف. بعد ذلك ، قم بتغطية الشرائح في 20 ميكرولتر من محلول ما قبل التهجين.

الحمض النووي للحيوانات المنوية لسمك السلمون بتركيز 100 ميكروغرام لكل ملليلتر لكل شريحة. ثم تحضن عند 42 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. يتم ذلك في صندوق مرطب معد مسبقا لضمان عدم جفاف المحلول أثناء هذه العملية.

في مرحلة ما بعد التهجين ، من المهم جدا أن يتم شطف محلول التهجين بالكامل من عيناتك. يمكن القيام بذلك في عمليات شطف متتالية لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة ، باستخدام أربعة أضعاف التركيز SSC ، ومرتين التركيز مرة واحدة في التركيز ، و 0.5 مرة في التركيز و 0.1 مرة في محلول SSC التركيز. كل حضانة لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

بعد الانتهاء من ذلك ، اغسل مع PBS ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها قبل إضافة مخزن الغسيل المؤقت. يجب شطف المخزن المؤقت للغسيل لمدة دقيقة واحدة قبل الخطوات التالية تأكد من أن مخزن الغسيل العازل جاف تماما من الشرائح قبل إضافة المحلول التالي. أضف 100 ملليلتر من محلول الحجب إلى كل شريحة واحتضن الشريحة لمدة 30 دقيقة.

من الأفضل القيام بذلك في بيئة خالية من الضوء لضمان تلطيخ جيد. بعد ذلك احتضان الشرائح لمدة 30 دقيقة مرة أخرى في 20 مل من محلول الأجسام المضادة. ضع محلول الأجسام المضادة مباشرة على الشرائح لتغطية كاملة لأنسجتك.

بمجرد اكتمال الحضانة ، ضع 100 ملليلتر من مخزن الغسيل المؤقت. احتضان لمدة 15 دقيقة في ظروف خالية من الضوء لإزالة مترافقات الأجسام المضادة غير المقيدة. قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل.

بعد ذلك ، ضع 20 ملليلتر من المخزن المؤقت للكشف وسمح له بالحضانة لمدة أربع دقائق تقريبا. بعد أربع دقائق، قم بإزالة المخزن المؤقت للكشف. جفف الشرائح لضمان عدم وجود حل إضافي وأضف 10 ملليلتر من محلول الركيزة الملونة المعد حديثا.

يبدأ هذا التفاعل في غضون بضع دقائق، ولكنه يكتمل بعد 16 ساعة. لذا اسمح للاحتضان لتلك الفترة الزمنية في حالة خالية من الضوء. بمجرد اكتشاف البقع المطلوبة حيث يتم الكشف عن العصابات ، اغسل الشريحة ب 50 ملليلتر من المخزن المؤقت TE لإيقاف التفاعل.

ثم أكمل عملية الجفاف وعملية التركيب الموضحة سابقا للعلكة المحايدة. يوضح الشكلان الأول والثاني طريقة طلاء الجيلاتين المصنوعة من الألومنيوم الكروم لأقسام البارافين وطريقة التضمين لملف تعريف التعبير عن FKBP12 و DmFKBP12 في تطوير أجنة ذبابة الفاكهة. ويبين الشكل الثالث توزيع البروتين للأجسام المضادة المكتشفة FKBP12 في مراحل الأديم الأرومي الخلوي المخلوي.

من هذه النتائج الكيميائية النسيجية ، يمكن ملاحظة أن تعبير FKBP12 أقل استقطابا في الأديم الأرومي المخلوي ، ثم يبدأ في التوطين داخل الغشاء السفلي تحت ظهارة الأديم التغذوي يعلم التدرج بمزيد من التعبير الموجود في القطبين الأمامي والخلفي. الشكل الرابع، الذي يتبع مراحل العلاقة الغازية المبكرة والمتأخرة لجنين ذبابة الفاكهة يظهر أن بروتين FKBP12 أصبح مقتصرا على مكونات معمارية معينة من الأنسجة الجنينية البدائية. مع توزيع أقل خارج الخلية من ذلك الذي لوحظ في المراحل الجنينية المبكرة والمتأخرة.

ومن المثير للاهتمام أن توزيع البروتين الديناميكي الموصوف أعلاه لا يصاحبه تغيرات مقابلة في مستويات التصوير بالرنين المغناطيسي ل FKBP12 كما هو موضح في الشكل الخامس. الإشارة إلى أن التعبير عن البروتين هو نتيجة لآلية جزيئية ما بعد النسخ لا تزال غير معروفة. تعد إشارات الكالسيوم بوساطة مستقبلات الرايانودين مسارا أساسيا في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية لكل من الحيوانات الفقارية واللافقارية.

من المعروف أن الطفرات في هذا الجين تسبب العديد من الاضطرابات الفسيولوجية التي تؤدي إلى المرض أو الموت القلبي المبكر. ومع ذلك ، كان من الصعب دراسة الدور الذي يلعبه هذا الجين في تطور ذبابة الفاكهة المبكرة. كمكون عابر للجنين ، فإن الجنين الغني بالدهون و chorion الغني بالكيتين ، يجعل دراسات البروتين والتعبير الجنيني في تطور ذبابة الفاكهة المبكرة صعبة.

سمح لنا طلاء الشرائح ، وتضمين الأجنة ، والتقنيات الكيميائية النسيجية المناعية الموصوفة في هذه الورقة بدراسة بالتفصيل التوزيع الديناميكي لبروتين مستقبلات الريانودين والحمض النووي الريبوزي المرسال. نحن نشارك هذه التقنيات ونأمل أن تسمح للآخرين بدراسة البروتينات الأخرى خلال مراحل التطوير المبكرة لذبابة الفاكهة.