الحصاد والتصنيف: خطوة مهملة في أبحاث أساليب البيوفيلم

الهدف العام لهذه الإجراءات هو حصاد وتصنيف الأغشية الحيوية بالطريقة المثلى من أجل زيادة قابلية التكاثر. سيتم عرض ثلاث تقنيات في هذا الفيديو ، يركز كل منها على الحصاد والتصنيف من نوع سطح مختلف. سيوضح هذا الفيديو التقنيات المناسبة لواحد ، دوامة وصوتنة البيوفيلم من سطح صلب غير مسامي مثل قسيمة البولي كربونات من مفاعل البيوفيلم CDC.

ثانيا، كشط وتجانس الأغشية الحيوية من سطح زجاج البورسليكات الصلب غير المسامي الموجود عادة في مفاعل التدفق بالتنقيط. وثالثا ، كشط ، دوامة ، وصوتنة البيوفيلم من سطح أنابيب السيليكون المسامية الموجودة عادة في نموذج القسطرة. مرحبا ، اسمي كيلي باكنغهام ماير هنا في مختبر أساليب البيوفيلم الموحد.

في مختبرنا ، نقوم بتقسيم طرق البيوفيلم إلى أربعة مكونات: النمو والعلاج وأخذ العينات والتحليل. في الأدبيات التي تمت مراجعتها من قبل النظراء ، عادة ما تكون تفاصيل كيفية أخذ عينات من الأغشية الحيوية أو حصادها وتصنيفها من سطح ما متفرقة. هذا هو السبب في هذا الفيديو.

نظرا لأن مختبرنا يقوم بتطوير واختبار طرق البيوفيلم الموحدة ، فقد أجرينا مراجعة شاملة للأدبيات حيث تم تحديد طرق حصاد وتصنيف الأغشية الحيوية الثلاثة الأكثر شيوعا. هذه الطرق هي دوامة وصوتنة البيوفيلم من قسيمة البولي كربونات ، وكشط وتجانس البيوفيلم من قسيمة زجاجية البورسليكات ، وكشط ، دوامة ، وصوتنة البيوفيلم من أنابيب السيليكون. على الرغم من أن الأساليب المكتوبة على الورق قوية ، إلا أننا نأمل أن يكون الفيديو الذي يحتوي على التفاصيل الفنية التي قدمتها زميلتي في العمل ليندسي ميلر وأنا مفيدا.

للبدء ، تنمو البيوفيلم الكاذب الزنجاري الناضج 15442 وفقا لمعيار ASTM E2562 ، طريقة الاختبار القياسية لتحديد كمية الزائفة الزنجارية Biofilm المزروعة مع القص العالي والتدفق المستمر باستخدام مفاعل البيوفيلم CDC. في نهاية فترة النمو التي تستغرق 48 ساعة ، استعد لمعالجة وأخذ عينات من القسائم وفقا لمعيار ASTM E2871 ، وهو طريقة الاختبار القياسية لتحديد فعالية المطهر ضد الأغشية الحيوية المزروعة في مفاعل الأغشية الحيوية CDC باستخدام طريقة الأنبوب الواحد. ثم أدخل واقيات رذاذ معقمة معقمة في أنابيب مخروطية معقمة سعة 50 ملليلتر باستخدام ملقط معقم باللهب.

كرر ذلك لجميع الأنابيب التي ستتلقى العلاج. لا تحتاج أنابيب كوبونات التحكم إلى واقي من الرذاذ. قم بإزالة قضيب من مفاعل الأغشية الحيوية CDC وشطفه في 30 ملليلتر من ماء التخفيف المعقم.

سيؤدي ذلك إلى إزالة الخلايا المرفقة بشكل فضفاض من البيوفيلم. أمسك القضيب بالتوازي مع أعلى المقعد فوق أنابيب العينة مع واقيات الرذاذ. باستخدام وجع ألين معقم باللهب ، قم بفك البراغي المحددة لإسقاط قسيمة مغلفة بالأغشية الحيوية في الأنبوب.

كرر ذلك للعدد المطلوب من القسائم. قم بإزالة واقيات الرذاذ ووضع واقيات الرذاذ في حاوية منفصلة للتعقيم. باستخدام ماصة مصلية سعة خمسة ملليلترات ، قم ببطء بماصة أربعة ملليلترات من العلاج أو التحكم في الأنابيب بحيث يتدفق السائل إلى داخل جدار الأنبوب.

قم بتدوير الجزء السفلي من الأنبوب بلطف بحيث يتم تشريد أي فقاعات هواء تحت القسيمة. اسمح لمدة 30 إلى 60 ثانية بين كل إضافة. في نهاية وقت التلامس المحدد ، ماصة 36 ملليلتر من المحايد في الأنابيب بنفس الترتيب الذي تم به تطبيق العلاج أو التحكم.

دوامة كل أنبوب على أعلى إعداد لمدة 30 زائد أو ناقص خمس ثوان وتأكد من تحقيق دوامة كاملة. ضع الأنابيب في رف الأنبوب معلقة في سونيكتور منزوع الغاز بحيث يكون مستوى الماء في الحمام مساويا لمستوى الماء في الأنابيب. قم بضبط العينات عند 45 كيلوهرتز ، وقوة 100٪ ، ووظيفة طبيعية لمدة 30 زائد أو ناقص خمس ثوان.

كرر دورات الدوامة والصوتنة وانتهى بدوامة نهائية ، لما مجموعه خمس دورات. أخيرا ، قم بتخفيف العينة بشكل متسلسل ، وقم بلوحة التخفيف على أجار R2A واحتضن الألواح لمدة 24 ساعة عند 36 درجة مئوية. عد المستعمرات حسب الاقتضاء لطريقة الطلاء وسجل البيانات.

هذه التقنية التالية لحصاد الأغشية الحيوية وتصنيفها مفيدة للقسائم الصلبة غير المسامية التي تعد المعيار في مفاعل التدفق بالتنقيط. تنمو البيوفيلم البيوفيلم الكاذب الزنجاري الناضج 15442 وفقا لمعيار ASTM E2647 طريقة الاختبار القياسية لتحديد كمية البيوفيلم البيوغرافي الزائف الزنجاري المزروع باستخدام مفاعل الأغشية الحيوية بالتنقيط مع القص المنخفض والتدفق المستمر. قم بإعداد محطة أخذ العينات لتشمل لوحة أخذ العينات ، والإيثانول بنسبة 95٪ في الكأس ، وموقد الكحول ، ومرقئ ، وأداة إزالة القسيمة ، والأكواب مع مياه تخفيف معقمة ، وأنابيب تخفيف لشطف القسائم.

قم بإيقاف تشغيل المضخة ، وإزالة غطاء القناة واستخدام أداة إزالة القسيمة المعقمة ومرقئ لإزالة القسيمة ، مع الحرص على عدم إزعاج البيوفيلم. شطف القسيمة عن طريق غمرها بلطف مع حركة سائلة في 45 ملليلتر من مياه التخفيف المعقمة الموجودة في أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر. عكس الحركة على الفور لإزالة القسيمة.

ضع القسيمة في كوب يحتوي على 45 ملليلتر من ماء التخفيف المعقم. كشط سطح القسيمة المغطى بالأغشية الحيوية في اتجاه هبوطي لمدة 15 ثانية تقريبا باستخدام ملعقة أو مكشطة معقمة. شطف ملعقة أو مكشطة عن طريق تحريكها في دورق.

كرر عملية الكشط والشطف ثلاث إلى أربع مرات لضمان التغطية الكاملة لسطح القسيمة. شطف القسيمة عن طريق الاحتفاظ بها بزاوية 60 درجة فوق الكأس المعقمة وسحب ملليلتر واحد من ماء التخفيف المعقم على سطح القسيمة. كرر ذلك لما مجموعه خمس غسلات.

الحجم النهائي في الكأس هو الآن 50 ملليلتر. العمل في خزانة السلامة الأحيائية ، تجانس عينة الأغشية الحيوية المكشطة. قم بإرفاق مسبار مجانس معقم بالمجانس.

ضع طرف المسبار في السائل وقم بتشغيل المجانس وقم بمنحدر يصل إلى 20،500 دورة في الدقيقة. تجانس العينة لمدة 30 ثانية. اخفض عدد الدورات في الدقيقة وأوقف تشغيل المجانس.

قم بتعقيم المسبار بين عينات الأغشية الحيوية عن طريق التجانس في تسعة ملليلتر تخفيف معقم فارغ عند 20،500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية كما هو موضح أعلاه. تجانس أنبوب تسعة ملليلتر من 70٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية وافصل المسبار واتركه يقف في أنبوب الإيثانول لمدة دقيقة واحدة. تجانس فراغين إضافيين للتخفيف.

أيضا ، يمكن استخدام مسبار مجانس معقم يمكن التخلص منه لكل عينة. قم بتخفيف العينة المتجانسة بشكل متسلسل ، وقم بلوحة التخفيفات على R2A باستخدام طريقة الطلاء المناسبة ، واحتضن الألواح لمدة 24 ساعة عند 36 درجة مئوية. عد المستعمرات وسجل البيانات.

هذه التقنية النهائية لحصاد الأغشية الحيوية وتصنيفها مفيدة للفيلم الحيوي المزروع في أنابيب مسامية مثل أنابيب السيليكون المستخدمة في نموذج القسطرة. لبدء هذا الإجراء ، قم بزراعة البيوفيلم E.coli 53498 الناضج في أنابيب قسطرة السيليكون. تحضير مواد أخذ العينات: أنابيب مغسولة ، أنبوب طرد مركزي معقم ، طبق بتري معقم فارغ ، مرقئ من الفولاذ المقاوم للصدأ معقم باللهب ، مقص ، مؤقت ، ومسطرة.

مع إيقاف المضخة مؤقتا ، استخدم 70٪ من الإيثانول لتنظيف الجزء الخارجي من الأنابيب. قم بقياس سنتيمترين من النهاية ، وتجنب المنطقة المتصلة بالموصل ، ووضع علامة على الأنابيب لتحديد مواقع القطع. باستخدام مقص معقم باللهب ، اقطع الأنابيب على علامة السنتيمترين.

شطف جزء الأنابيب لإزالة الخلايا العوالق. باستخدام ملقط معقم باللهب ، اغمر مقطع الأنابيب بلطف في 20 ملليلتر من ماء التخفيف المعقم ، ثم أزله على الفور. ضع الجزء في 10 ملليلتر من المحايد.

باستخدام ملقط معقم باللهب ، أمسك جزء الأنابيب وكشطه بعصا قضيب خشبية معقمة حتى يتم كشط جميع المناطق الداخلية للأنابيب. في بعض الأحيان شطف العصا في 10 ملليلتر من المعادل ووضع الجزء مرة أخرى في أنبوب العينة. جزء الأنابيب المكشطة هو الآن 10 إلى الصفر أو التخفيف الصفري.

دوامة كل أنبوب على أعلى إعداد لمدة 30 زائد أو ناقص خمس ثوان. ضع الأنابيب في رف الأنبوب المعلق في حمام سونيكتور ، بحيث يكون مستوى الماء في الحمام مساويا لمستوى السائل في الأنابيب. سونيكات عند 45 كيلوهرتز ، قوة 100٪ ، ووظيفة طبيعية لمدة 30 زائد أو ناقص خمس ثوان.

كرر هذه الدوامة ودورة الصوتنة ، ثم تنتهي بالدوامة النهائية. قم بتخفيف العينات بشكل متسلسل في الماء العازل. طبق على أجار الصويا التربتيك باستخدام طريقة الطلاء المناسبة ثم احتضن الأنابيب عند 36 زائد أو ناقص درجتين مئويتين لمدة 24 ساعة.

عد المستعمرات حسب الاقتضاء لطريقة الطلاء المستخدمة وسجل البيانات لحساب المتوسط الحسابي. تساعد هذه الصور الأربع التي التقطتها دانييل أور وبلين فريتز على توضيح أهمية إجراء الحصاد والتصنيف هذا. تم تلطيخ جميع هذه القسائم الأربعة باللون البنفسجي البلوري للمساعدة في تصور كمية البيوفيلم Pseudomonas aeruginosa الموجود على القسائم قبل وبعد الدوامة وعملية الصوتنة.

القسيمة A مغطاة بالكامل في البيوفيلم ، في حين أن القسائم B و C و D تحتوي جميعها على فيلم حيوي أقل بكثير على سطحها. خضعت جميع القسائم B و C و D لعملية الدوامة والصوتنة الموضحة سابقا. هاتان الصورتان اللتان التقطتهما ليندسي ميلر على مجهر متحد البؤرة عند تكبير 12.5X تصور فيلما حيويا من Pseudomonas aeruginosa تمت معالجته ببقعة حية / ميتة في الضوء الخلفي.

تم صوتنة الصورة على اليسار عند 45 كيلوهرتز و 10٪ من الطاقة ، في حين أن الصورة على اليمين كانت صوتية عند 45 كيلوهرتز و 100٪ من الطاقة. من الواضح أن القسيمة الموجودة على اليسار لديها المزيد من البيوفيلم المتبقي على سطحها مقارنة بالقسيمة الموجودة على اليمين. يعرض هذا الشكل النهائي كيف يؤثر التلاعب بمعلمات الصوتنة المختلفة على كمية البيوفيلم Pseudomonas aeruginosa الذي تمت إزالته من سطح القسيمة.

تم تشغيل جميع هذه القسائم بسرعة 45 كيلوهرتز ، وقوة 100٪ ، وفي الإعداد العادي لمدة 30 ثانية زائد أو ناقص خمس ثوان. تم التقاط هذه الصور بتكبير 12.5X بواسطة Lindsey Miller. تم صوتنة القسائم في الصف الأول في ماء التخفيف ، في حين تم صوتنة القسائم في الصف الثاني في مرق تحييد DE.

يبدو أن هناك كمية أقل من البيوفيلم المتبقي على القسائم التي تم صوتها في مرق DE الذي يحتوي على خافض للتوتر السطحي مقارنة بالماء المخفف. تم صوتنة جميع القسائم A و B و E و F بحجم 10 ملليلتر ، في حين تم صوتنة القسائم C و D و G و H في 40 ملليلتر من المحلول. من الواضح أن هناك كمية أقل من البيوفيلم على القسائم التي تم صوتها في الأحجام الأصغر.

تم صوتنة القسائم A و C و E و G في الحمام بثلاثة أنابيب في وقت واحد ، في حين تم صوتنة القسائم B و D و F و H في حمام مع 12 أنبوبا في وقت واحد. يبدو أن العينات الصوتية مع عدد أقل من الأنابيب أظهرت حصادا متفوقا للأغشية الحيوية. في نهاية المطاف ، يبدو أن تقليل الحجم في الأنابيب ، وتقليل عدد الأنابيب الصوتية في وقت واحد ، واستخدام مرق تحييد DE ، كلها تساهم في تعزيز حصاد الأغشية الحيوية.

لا توجد طريقة مثالية لحصاد وتصنيف الأغشية الحيوية ، ولكن بعض الأساليب أفضل للأسطح و / أو التطبيقات المختلفة. التقنيات الموضحة في هذا الفيديو هي الطرق الثلاث الأكثر شيوعا وفقا لمراجعة الأدبيات. هذه التقنيات الثلاث يمكن أن توفر نقطة انطلاق للباحثين.

من المهم أن تأخذ الوقت الكافي للتحقق من صحة طريقة الحصاد والتصنيف المختارة. تختلف جميع المعدات قليلا ، لذلك حتى لو تم توحيد الطريقة ، فلا يزال من الحكمة تأكيد عملية المعدات المستخدمة. أظهرت الأبحاث أن الخيارات غير الصحيحة قد تؤدي إلى نتائج اختبار متحيزة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، نأمل أن تساعد هذه المعلومات الباحثين على اتخاذ قرارات أكثر استنارة بشأن الطريقة التي يجب استخدامها وتقديم إرشادات حول تحسين قابلية التكاثر لأنواع الأسطح الثلاثة وتقنيات الحصاد والتصنيف المجانية.