التصوير الطولي داخل الحيوية من خلال نوافذ السيليكون الشفافة

هذا الإجراء لصب وإدخال نوافذ السيليكون يقلل من الحواجز التقنية للتصوير الطولي داخل الحيوية. ينتج بروتوكولنا نوافذ قوية وقابلة للتكيف بسهولة وتتحملها الحيوانات بشكل جيد. باستخدام هذه التقنية ، قمنا بتصوير الخلايا السرطانية والمناعية في الكبد والبنكرياس والغدة الثديية.

مع الحد الأدنى من التعديلات ، يمكن تكييفها مع العديد من المواقع التشريحية والأسئلة البيولوجية. بالنسبة لأولئك الذين يجربون هذه التقنية لأول مرة ، تدرب على إطلاق كميات صغيرة من الغراء من المحقنة. سيؤدي تطبيق الكثير من الغراء إلى تعتيم مجال التصوير ويجعل من الصعب التعامل مع المنطقة الجراحية.

ابدأ في صب نافذة السيليكون عن طريق إيداع كمية صغيرة من بوليمر السيليكون الطازج ، polydimethylsiloxane ، من PDMS ، على سطح أملس نظيف ، وضبط نسبة الحجم إلى المنطقة للحصول على السماكة المطلوبة. بمجرد ترسب PDMS على سطح الصب المطلوب ، اضغط برفق على شبكة الفولاذ المقاوم للصدأ في السيليكون لتوفير معالم للتصوير المتكرر لنفس مناطق الأنسجة. لإزالة فقاعات الهواء وإزالة بوليمر السيليكون ، ضع السطح المطلي في مجفف فراغ لمدة 45 دقيقة.

عند الانتهاء ، عالج البوليمر في فرن عند 75 إلى 80 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. سجل البوليمر عند حواف القالب واستخدم الملقط لتقشير النوافذ المعالجة بلطف من السطح المستخدم في الصب. ضع الماوس على موضع الاستلقاء الجانبي الأيسر.

قم بإعداد الفأر المخدر للجراحة عن طريق تطبيق 10٪ من الحجم من محلول اليود البوفيدون و 70٪ من الحجم من الإيثانول ثلاث مرات متتالية على موقع الجراحة المحلوق. يجب توخي الحذر للحفاظ على مجال جراحي معقم. بعد ذلك ، استخدم مقص وملقط معقم لإجراء شق 10 ملم على الجناح الأيمن عند ثلاثة ملليمترات أسفل القوس الساحلي.

قم بإزالة قسم سنتيمتر مربع واحد من الجلد واستخدم زوجا ثانيا من المقص المعقم والملقط لإزالة جزء من الصفاق أصغر قليلا من قسم الجلد. قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على صفيحة بئر معقمة واسحبها باستخدام حقنة قياس 31 لتطبيقها على سطح الكبد حول حواف المنطقة المراد تصويرها ، ثم ضع النافذة على المنطقة المطلوبة ، وأمسكها بإحكام على الكبد لمدة دقيقتين تقريبا حتى تجف المادة اللاصقة. بعد طي حواف النافذة تحت الصفاق ، قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على حواف النافذة الموجودة الآن تحت الصفاق ، وادفع لأسفل على الصفاق باستخدام ملقط لتثبيته على النافذة.

وبالمثل ، قم بإغلاق الصفاق عن طريق إيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية قبل دفع الجلد لأسفل ، ثم ضع الغراء حول حواف النافذة لإنشاء حافة تمنع الجلد من النمو مرة أخرى فوق النافذة. لإدخال النافذة في البنكرياس ، ضع الماوس على وضع الاستلقاء الجانبي الأيمن ، وقم بعمل شق على الجناح الأيسر قبل إزالة جزء من الصفاق كما هو موضح سابقا. باستخدام مسحات قطنية معقمة غارقة في محلول ملحي معقم ، اسحب الطحال بلطف لتصور البنكرياس.

أعد وضع البنكرياس باستخدام مسحات القطن المبللة لجعل مساحة السطح مرئية من خلال الشق. بمجرد الوصول إلى البنكرياس ، أدخل وأغلق نافذة التصوير على المنطقة المطلوبة كما هو موضح من قبل. للوصول إلى الغدة الثديية ، ضع الماوس في وضع ضعيف ، وقم بعمل شق إنسي 10 ملليمتر إلى إحدى الحلمات الإربية باستخدام مقص وملقط معقم.

قم بإزالة قسم مساحته 0.5 سنتيمتر مربع من الجلد فوق الغدة الثديية ، ثم افصل الغدة الثديية بلطف عن الجلد عن طريق نشر المقص المعقم بين السطحين لتعطيل الالتصاق. استخدم حقنة قياس 31 لتطبيق كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على سطح الغدة الثديية حول حواف المنطقة المراد تصويرها. ضع النافذة وأمسكها بإحكام ضد الغدة الثديية حتى تجف المادة اللاصقة.

بعد طي حواف النافذة تحت الجلد ، قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على حواف النافذة الموجودة الآن تحت الجلد ، وادفع الجلد لأسفل باستخدام ملقط لتثبيت الجلد على النافذة. ضع الغراء حول حواف النافذة لإنشاء حافة تمنع الجلد من النمو مرة أخرى فوق النافذة. قبل البدء في جلسة التصوير ، قم بتنظيف النافذة من أي حطام متبقي عن طريق مسحها بلطف باستخدام قطعة قطن مغموسة في 70٪ من الإيثانول.

عند استخدام عدسة الغمر بالماء ، ضع هلام الموجات فوق الصوتية على النافذة لتجنب الفقاعات. لبدء التصوير ، حدد موقع الشبكة ووضعها في التركيز من خلال المناظير. ثم حدد عمق تصوير الأنسجة التقريبي عن طريق تعيين الجزء السفلي من الشبكة إلى الصفر.

ستساعد المعلومات في تحديد موقع المستوى Z المقابل في جلسات التصوير اللاحقة. لتحديد نفس الموقع عبر جلسات تصوير متعددة، استخدم المربعات الموجودة على الشبكة كنقطة مرجعية. أثناء جلسة التصوير، لاحظ اتجاه الشبكة وموقع كل مجال رؤية تم تصويره داخل الشبكة.

يمكن استخدام الشبكة للانتقال مرة أخرى إلى مناطق شبكة محددة ومجالات تصوير في نجاح جلسات التصوير. بعد كل جلسة تصوير، قم بإزالة أي وسط غمر للعدسة المتبقية والحطام عن طريق مسح النافذة بلطف باستخدام قطعة قطن مغموسة في 70٪ من الإيثانول. تسمح نافذة السيليكون بالتقاط تسلل الخلايا المناعية الديناميكية بمرور الوقت.

يوضح التحليل التمثيلي تسلل العدلات داخل أنسجة الغدة الثديية المعاد تشكيلها في اليومين الثاني والرابع. تسمح نافذة السيليكون بتصور الأورام في نقاط زمنية متعددة على مدار أسابيع بعد إدخال النافذة. النوافذ المصبوبة مع 200 ملليغرام من PDMS هي عموما أفضل للزرع الجراحي لأنها أظهرت صلابة أكبر بكثير من النوافذ المصبوبة مع 150 ملليغرام.

تجدر الإشارة إلى أن نوافذ PDMS لم تكن صلبة مثل الزجاج القياسي ، ممثلة في معامل يونغ للنوافذ الزجاجية التي كانت أكبر بكثير من PDMS. كان إدخال النافذة في أعضاء مختلفة جيد التحمل حيث استمرت معظم الفئران في زيادة الوزن بمرور الوقت. أهم شيء يجب تذكره عند محاولة هذا الإجراء هو إغلاق النافذة بالكامل باستخدام الغراء.

هذا يمنع العدوى ، والأنسجة من الجفاف ، وإزاحة النافذة. بعد الإجراء ، يمكن إجراء الحقن التقويمي من خلال نافذة السيليكون ، مما يسمح للباحثين بدراسة مجموعة واسعة من الموضوعات ، مثل تكاثر الخلايا ، والتفاعلات بين الخلايا الخلوية ، والفعالية العلاجية.