وضع العلامات على الحويصلات خارج الخلية لرصد الهجرة والإقبال في الغضاريف Explants

يسمح هذا البروتوكول البسيط للمرء بتسمية المركبات الكهربائية ومراقبتها عن طريق المجهر الكونفوفيكال. على سبيل المثال، قد يساعد التصوير EV في تقييم توزيع EV عند استخدامه في العلاجات. هذه التقنية تسمح للمرء لرصد الهجرة EV واستيعاب في explants الغضاريف بسهولة، مع المجهر confocal دون أي وظيفة خاصة.

يمكن استخدام نفس البروتوكول للمركبات الكهربائية في المختبر أو في تجارب الجسم الحي. تأكد من أن يتم إعداد الأعمدة مسبقا، وأن الحجم الأولي من المركبات الكهربائية يكفي للوصول إلى تركيز الجسيمات النهائي المطلوب، معتبرا أن حوالي 10٪ من الجسيمات سوف تضيع خلال خطوة تنقية. ابدأ بتركيز الحويكل خارج الخلية، أو EV، العينة والتحكم.

ضع العينات في أنبوب تركيز 15 ملليلتر أو 500 ميكرولتر، اعتمادا على الحجم الأولي لعينة EV. طرد الأنابيب وفقا لتعليمات الشركة المصنعة حتى يتم الحصول على عينة جافة تقريبا. إعادة تعليق عينات EV المركزة مع 200 ميكرولتر، ومجموعة التحكم مع 100 ميكرولتر من السيلتر C، ونقلها إلى أنابيب طرد مركزي جديدة 1.5 ملليلتر.

فصل عينة EV إلى اثنين من aliquots من 100 ميكرولتر لكل منهما. مارك واحدة من aliquots مع صبغ واستخدامها كعلاج. اترك الآخر بدون علامة ، ولكن قم بمعالجته مثل عينة EV ، واستخدمه لتحديد تركيز EV عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية.

إعداد محلول صبغ 2x بحيث التركيز الناتج من محلول PKH26 في C diluent هو ثمانية ميكرومولار. اخلط ميكرولتر واحد من وصلة PKH26 أحادية المليمول لكل 125 ميكرولتر من الذوبان C في العينة. إعداد وحدة التخزين المطلوبة لإضافتها إلى العينات بنسبة 1:1.

إضافة محلول صبغ 2x إلى PKH الصفائح الدموية المركبات الكهربائية المشتقة من الليسات وعينات التحكم في نسبة 1:1، لتحقيق تركيز صبغة 1x، وأربعة تركيز PKH26 ميكرومولار. أضف نفس حجم برنامج تلفزيوني إلى عينة EV المشتقة من الصفائح الدموية NTA. احتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

إضافة 5٪ مصل البقر الألبومين-PBS الحل للعينات في نسبة 1:1، وضمان أن الحجم النهائي هو ما يقرب من 400 ميكرولتر. تابع لفصل المركبات الكهربائية المسماة عن الصبغة غير المنضمة وتفاعلات الصبغة غير المحددة مع العمود. إزالة الغطاء من العمود، إضافة 400 ميكرولتر من الصفائح الدموية PKH المركبات الكهربائية المشتقة من الصفائح الدموية، NTA الصفائح الدموية المشتقة من المركبات الكهربائية، أو السيطرة والتخلص من جميع السائل الملتح.

انتظر حتى تدخل العينة العمود تماما قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. إضافة 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وتجاهل جميع السائل الملتوية. انتظر برنامج تلفزيوني لإدخال العمود تماما قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.

إضافة 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وجمع جزء صغير من 600 ميكرولتر في أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر. بالنسبة لعمود جديد، كرر الخطوات التي تتضمن تركيز العينات المذكورة في بداية البروتوكول. إضافة 600 ميكرولتر من EVs التي تم إلتواءها سابقا إلى العمود وتجاهل وحدة التخزين الملتوية.

ثم أضف 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وتجاهل جميع وحدات التخزين الملتوية. إضافة 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني إلى العمود وجمع جزء صغير من 600 ميكرولتر في أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر. غسل الغضروف مرتين مع برنامج تلفزيوني والمكوس باستخدام لكمة خزعة قطرها ثلاثة ملليمترات في ظل ظروف معقمة.

وضع explants في لوحات ثقافة 96 جيدا مع DMEM-F12 المتوسطة، تكملها مع 1٪ من العقديات البنسلين في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2، والرطوبة 80٪. لإنشاء نموذج الزراعة العضوية المدفوعة بالالتهاب ، قم بمكمل متوسط ثقافة الخلية مع 10 نانوغرام لكل ملليلتر من oncostatin M واثنين من النانوجرام لكل ملليلتر من عامل نخر الورم ألفا. علاج explants مع 1 مرات 10 إلى الجسيمات 9 لكل بئر من PKH الصفائح الدموية المشتقة من التحلل المركبات الكهربائية، أو السيطرة، في خلية ثقافة المتوسطة تكملها oncostatin M ونخر الورم عامل ألفا.

إزالة المتوسطة من لوحات ثقافة الخلية 96 جيدا التي تحتوي على explants الغضاريف. أضف 200 ميكرولتر من وسيط ثقافة الخلية إلى كل بئر كما هو موضح في المخطوطة. أوقف الفحص في المختبر كل ساعة من صفر إلى خمس ساعات.

غسل آبار ثقافة الخلية التي تحتوي على explants الغضاريف مرتين مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. إضافة 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد إلى الأنسجة لإصلاحه لمدة ثلاث ساعات في أربع درجات مئوية. إزالة PFA، إضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، وتخزين الأنسجة الثابتة في أربع درجات مئوية، ومعالجة العينات في غضون 48 ساعة.

تظهر الصور الملتقطة في نقاط زمنية مختلفة كيف تدخل المركبات الكهربائية الأنسجة حتى تصل إلى الخلايا الشوندرية، وتدخل الشوندروسيتيات بمرور الوقت. تم بالفعل توطين المركبات الكهربائية المسماة حول chondrocytes بعد ساعة واحدة من الحضانة. تأكد من أن الحجم الأولي للمركبات الكهربائية يكفي للوصول إلى تركيز الجسيمات النهائي المطلوب.

شيء آخر مهم أن نتذكر هو استخدام المركبات الكهربائية المسمى في غضون الساعات ال 24 المقبلة. إذا لم يتم استخدامه في غضون 24 ساعة ، فقد يحدث انخفاض في الفلورسينس. ستساعد هذه التقنية الباحثين على تحسين التصوير EV ، ودراسة المركبات الكهربائية في علم الأحياء والعلاجات.