قياسات انقباضية عالية الإنتاجية لألياف عضلات الفأر السليمة المضمنة في الهيدروجيل باستخدام نظام قائم على البصريات
مايو 5, 2023
يمكن تقييم وظيفة العضلات الهيكلية عن طريق تحديد انقباض ألياف العضلات المعزولة ، وذلك تقليديا باستخدام أساليب شاقة منخفضة الإنتاجية. هنا ، نصف طريقة عالية الإنتاجية قائمة على البصريات لتحديد انقباض ألياف العضلات المدمجة في الهيدروجيل. هذا النهج له تطبيقات لفحص الأدوية والتطوير العلاجي.
يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم تأثير الطفرات الجينية على وظيفة الألياف العضلية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدامه لدراسات فحص المخدرات التي تهدف إلى تحسين صحة العضلات. يمكن استخدام هذه التقنية لعزل وقياس الانقباض في عدد كبير من ألياف العضلات في فترة زمنية قصيرة نسبيا دون الحاجة إلى تدريب متقدم.
يمكن تغيير تكوين الهلاميات المائية من أجل إثبات تأثير الإشارات البيئية في كل من العضلات السليمة والمريضة. الجزء الأكثر تحديا في الإجراء هو التشريح الأولي للعضلة. إذا لم يتم توخي الحذر الكافي ، يمكن أن يؤدي تلف العضلات إلى انخفاض في صلاحية ألياف العضلات.
سيوضح الإجراء ليندر فونك ، فني أبحاث ، وعثمان إيسن ، مرشح الدكتوراه في مختبري. ابدأ بقطع الساق الخلفية السفلية للفأر الرحيم فوق الكاحل مباشرة. قم بعمل شق على الجلد على الجانب الظهري من القدم باتجاه أصابع القدم.
قشر الجلد بعناية نحو أصابع القدم مع الحرص على عدم إتلاف العضلات. ضع القدم المشرحة في طبق واقي للختم يحتوي على 10 ملليلتر من وسط التشريح المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية. دبوس القدم من خلال الجلد لا يزال متصلا بأصابع القدم.
ثبت أسفل الساق خارج الكاحل واستأصل بعناية النسيج الضام أعلى العضلات. قطع الوتر عند الكعب ورفع العضلات. قطع جنبا إلى جنب مع وتحت العضلات من خلال النسيج الضام حتى تنكشف أوتار إصبع القدم.
قطع الأوتار عندما يتعرض نصف طول الأوتار الثلاثة. حرر العضلات من القدم وثبت أوتار عضلات FDB. قم بإزالة أي نسيج ضام متبقي من العضلات.
انقل الأنسجة العضلية النظيفة إلى أنبوب يحتوي على وسط تشريح تم تسخينه مسبقا. استخدم ماصة مصلية لنقل العضلة الحجية إلى أنبوب يحتوي على وسط هضم العضلات. ضع المنديل في حاضنة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 80 دقيقة.
نقل العضلات إلى أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على ثلاثة ملليلتر من وسط التشريح. باستخدام أطراف التثليج المعدة ، تنتقل ماصة العضلات من الأكبر إلى الأصغر وتستمر في التثليج حتى تخرج ألياف العضلات من الوتر. يمكن إزالة الأوتار بطرف P200.
انقل الألياف العضلية المنفصلة إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا يحتوي على 10 ملليلتر من وسط التشريح. اترك الألياف تستقر في الحاضنة لمدة 20 دقيقة حتى تتشكل حبيبة. ماصة بعناية كل وسيط من أعلى بيليه الألياف.
على الجليد ، أعد تعليق الخلايا في 875 ميكرولتر من مزيج الخلايا لكل عضلة. أضف 125 ميكرولترا من مزيج خلايا المصفوفة في أنابيب تحتوي على 125 ميكرولترا من قسمة تعليق الخلية. تخلط عن طريق ماصة لطيفة ، وتجنب تشكيل فقاعات.
انقل المزيج النهائي على الفور إلى بئر. تحقق من صلاحية ألياف العضلات تحت المجهر. ضع المواد الهلامية في حاضنة لمدة 30 إلى 45 دقيقة لتعزيز التصلب.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، أضف بعناية 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع في كل بئر. قم بتشغيل نظام القياس المقلص القائم على البصريات ، ومصباح الفلورسنت ، وجهاز قياس الخلايا الكهربائية ، والكمبيوتر. اضبط المحفز الكهربائي على 1.0 هرتز عند 10 فولت مع مدة نبضة تبلغ خمسة مللي ثانية لتحفيز ألياف العضلات المعزولة.
أدخل اللوحة في نظام القياس. قم بتوصيل pacer بالملحق وأدخله في لوحة الثقافة. افتح برنامج IonWizard.
انقر فوق موافق. افتح ملفا جديدا بالنقر فوق رمز ملف ، ثم انقر فوق جديد. حدد تجميع التجربة للتحقق مما إذا كان البرنامج يستخدم القطعة العضلية الهيكلية للتجربة الصحيحة. لتغيير التجربة ، انقر فوق التجربة المطلوبة ثم اضغط على إضافة.
قم بتطبيق الإعدادات SARC 20X ، ومتوسط الخطوط ، و FFT الفردي ، ومعدل أخذ العينات 250 هرتز ، ووقت الاستحواذ 10 ثوان. قم بتغيير درجة حرارة نظام القياس إلى 25 درجة مئوية. انقر فوق مكتشف الخلية المفتوح لإنشاء نافذة منبثقة جديدة للشاشة.
حدد نوع اللوحة والآبار النشطة. ركز الألياف عن طريق ضبط شريط تمرير التركيز. قم بتمكين السرعة للحث على التحفيز الكهربائي ومراقبة ارتعاش الألياف.
مع الحفاظ على القطع العضلية في بؤرة التركيز ، تأكد من تثبيت منطقة القياس على طرف الألياف بحيث تعمل القطع العضلية عموديا. عند تركيز القطع العضلية، تظهر قمة واحدة في شريط الأدوات تتحرك إلى اليمين عند الانقباض. قياس الألياف على نظام القياس.
النقرات ابدأ لبدء التجربة. اضغط على المفتاح Q لبدء قياس 10 انكماش عابر. إذا بدا أكثر من أربعة عابرين خاليين من الضوضاء ، فاقبل القياس بالضغط على المفتاح Z.
إذا كانت العابرات تحتوي على الكثير من الضوضاء ، فارفض القياسات. اضغط على إيقاف لإغلاق نافذة مكتشف الخلايا بمجرد انتهاء التجربة. احفظ الملف وأنشئ ملفا جديدا.
افتح برنامج CytoSolver لسطح المكتب ، ثم انقر فوق استيراد وحدد الملفات المراد تحليلها. بمجرد اكتمال التحليل ، حدد القمم الزرقاء والحمراء والرمادية. انقر فوق تصدير.
حدد المربعات التي تحمل عنوان المتوسط إلى البيانات العابرة وقم بالتصدير إلى Excel. تم الحصول على نسبة أعلى من قياسات العضلات المقلصة القابلة للاستخدام في هيدروجيل الفيبرين 3D لأنه منع الحركات الجانبية والعوامل المؤثرة الأخرى. لم يكن لتضمين الألياف تأثير كبير على سرعة الانكماش القصوى أو تقصير القطعة العضلية.
لوحظ انخفاض الانكماش في مصفوفة القاع النقي على الأرجح بسبب صلابة الهلام أو زيادة تفاعل مصفوفة الخلية. وبالمثل ، أدى تضمين مصفوفة الطابق السفلي أيضا إلى تقليل تقصير القطعة العضلية مقارنة بهيدروجيل الفيبرين. من المهم أن تتذكر أن ألياف العضلات المعزولة هشة للغاية ويجب توخي الحذر الشديد حتى لا تتلفها أثناء سحب الماصة.
بعد إجراء العزل ، يمكن أيضا إجراء طرق مثل التلوين المناعي وعزل البروتين والحمض النووي الريبي. وقد فتح تطوير هذه التقنية إمكانيات جديدة لدراسة وظيفة الألياف العضلية الناضجة بطريقة عالية الإنتاجية.
المحة عامة
تصف هذه المقالة طريقة عالية الإنتاجية، تعتمد على البصريات، لتحديد انقباض ألياف العضلات المدمجة في الهلام الهلامي، وتعالج القيود المفروضة على التقنيات التقليدية منخفضة الإنتاجية. يتيح هذا النهج تقييمات الطفرات الوراثية ويدعم جهود فحص الأدوية التي تهدف إلى تحسين صحة العضلات.
مكونات الدراسة الرئيسية
منطقة البحث
- وظيفة العضلات الهيكلية
- الفحص عالي الإنتاجية
- التطوير العلاجي
الخلفية
- الطرق التقليدية شاقة ومنخفضة الإنتاجية.
- تقييم انقباض ألياف العضلات المعزولة أمر بالغ الأهمية لفهم صحة العضلات.
- يمكن تعديل الهلام الهلامي للتحقيق في التأثيرات البيئية على وظيفة العضلات.
الطرق المستخدمة
- عزلة وهضم ألياف العضلات من أنسجة الفئران
- نظام قياس انقباضي يعتمد على البصريات
- التحليل باستخدام برنامج لبيانات الانقباض
النتائج الرئيسية
- سمحت التقنية المطورة بقياس الانقباض في العديد من ألياف العضلات بشكل فعال.
- التثبيت في هلام الفيبرينات ثلاثي الأبعاد عزز من موثوقية القياس.
- أثرت التغييرات في تركيب الهلام في مقاييس وظيفة العضلات.
الاستنتاجات
- تقدم هذه الدراسة نهجًا جديدًا لدراسة وظيفة ألياف العضلات بطريقة عالية الإنتاجية.
- ذات صلة لكل من البيولوجيا الأساسية والتطبيقات العلاجية في صحة العضلات.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
High-throughput contractile measurement of hydrogel-embedded intact mouse muscle fibers enables robust functional assessment of skeletal muscle in discovery-stage research. This optics-based system supports scalable evaluation of genetic mutations and pharmacological interventions, directly impacting target validation and early screening workflows. The approach enhances predictive confidence for muscle-related therapeutic programs and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of genetic mutations affecting muscle contractility.
- Supports biological de-risking by preserving native muscle architecture in ex vivo assays.
- Facilitates rapid hypothesis testing for muscle-targeted therapeutic strategies.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, physiologically relevant muscle fiber systems for compound screening.
- Delivers quantitative, reproducible contractile readouts for assay standardization.
- Enables high-throughput evaluation of pharmacological agents on muscle function.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for genetic muscle disorder studies.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation of muscle-targeted interventions.
- Supports risk-adjusted advancement of muscle health programs.
Pipeline & Workflow Integration
This optics-based contractility system integrates from early discovery through lead identification and preclinical research for muscle-targeted therapies.
- Discovery Biology: Supports mechanistic hypothesis testing and pathway clarification in muscle function.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible contractile measurements for compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative outputs such as sarcomere shortening and contraction velocity for comparative analysis.
- Translational Research: Enables ex vivo modeling of genetic muscle disorders for translational continuity.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable platform for diverse muscle biology and pharmacology studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in muscle-targeted programs.
- Operational Value: Standardizes contractile measurements and enhances throughput for screening campaigns.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency in early-stage muscle research.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of muscle health and genetic disorder assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in muscle dissection and ex vivo tissue handling.
- Needs access to optics-based contractile measurement instrumentation and compatible analysis software.
- Demands careful standardization of hydrogel composition and electrical stimulation parameters.
- Adaptable to different muscle models and environmental conditions for broader application.
- Muscle fiber fragility and dissection complexity may limit throughput if not carefully managed.
