تحليل مبسط وعالي الإنتاجية لانقباض الخلية الواحدة باستخدام اللدائن المطاطية ذات الأنماط الدقيقة

يقدم هذا العمل بروتوكولا مرنا لاستخدام تكنولوجيا الأسطح المرنة القابلة للانكماش (FLECS) ذات العلامات الفلورية في شكل ميكروويل من أجل تحديد كمي مبسط وغير مباشر لقوى الانقباض أحادية الخلية استنادا إلى الإزاحة المرئية للأنماط الدقيقة للبروتين الفلوري.

القوى الميكانيكية الناتجة عن الخلايا ضرورية للوظيفة المناسبة في مختلف الأعضاء في جميع أنحاء الجسم. بالإضافة إلى الأمعاء المثانة والقلب وغيرها. يجب أن تولد هذه الأعضاء أنماطا مستقرة من تقلص الخلايا والاسترخاء ، للحفاظ على حالة مرقئ داخلي.

يمكن أن يؤدي تقلص خلايا العضلات الملساء غير الطبيعي إلى ظهور اضطرابات مختلفة ، بما في ذلك خلل الحركة المعوي الذي يميز الأنماط غير الطبيعية للأمعاء مع تقلص العضلات ، وكذلك حالات مثل فرط النشاط أو ضعف نشاط المثانة. وفي مجرى الهواء ، يمكن لبعض خلايا العضلات التي تنقبض على أي أنماط غير منتظمة أن تؤدي إلى فرط الاستجابة الربو. من الواضح أن آليات الانقباض داخل الخلايا والأنسجة يمكن أن تؤدي إلى أمراض تتطلب خيارات علاجية.

وبما أن هذه الظروف يمكن أن تنبع مباشرة من السلوكيات الانقباضية المختلة وظيفيا للخلايا، يصبح من المنطقي والضروري قياس وظيفة انقباض الخلية نفسها، عند فحص الأدوية المرشحة المحتملة. بعد التطورات الحديثة في التكنولوجيا الدقيقة ، قمنا بتطوير اختبار قائم على الألواح الدقيقة سهل الاستخدام يتيح القياسات الكمية لتقلص الخلية الواحدة. في مئات الآلاف من الخلايا تسمى flex ، والمعروفة أيضا باسم الأسطح القابلة للانكماش المطاطية المسماة بالفلورسنت.

في هذا النهج ، نقوم بتضمين أنماط البروتين الفلوري الدقيقة ، وبالتالي الأفلام الناعمة ، التي تتشوه وتتقلص عندما تطبق الخلايا قوى الجر عليها. الأهم من ذلك ، أن أنماط البروتين الدقيقة تقيد موضع الخلية وشكلها ومنطقة انتشارها. ظروف الاختبار الموحدة وتسمح بقياسات بسيطة تعتمد فقط على تغييرات أبعادها.

وبشكل عام، تتيح المنصة، التي تتضمن وحدة تحليل صور تعتمد على المتصفح، تحليلا مباشرا لقوة الخلايا القابلة للتعاقد دون الحاجة إلى إجراءات معالجة دقيقة أو تسجيل علامات ائتمانية، ويمكن تشغيلها من قبل أي باحث باستخدام مزارع الخلايا الأساسية والمجهر الفلوري البسيط مع تكبير منخفض. تم تصميم هذه التقنية مع وضع المستخدم النهائي في الاعتبار ، وتهدف إلى تقليل الحاجز أمام دخول أي عالم مختبر لدراسة بيولوجيا القوة الخلوية ابدأ بإضافة 20 ملليلتر من الوسائط إلى أنبوب مزمن ، والحصول على لوحة من 24 بئرا مصممة لفحص انقباض الخلايا. اضبط ماصة على 500 ميكرولتر واحصل على مصفاة خلية لمسببات الخلايا.

قم بإزالة الغطاء الموجود على اللوحة المكونة من 24 بئرا ، وأمسك اللوحة على هذا النحو ، ثم تابع خلع طبقة البلاستيك الموجودة أعلى اللوحة برفق. اضبط اللوحة بعناية مرة أخرى. قم بشفط PBS من الطبقة العليا فقط من كل بئر لمنع أي انسكاب.

الآن ، صف واحد في كل مرة ، قم بإزالة PBS المتبقية من البئر واملأها بسرعة ب 500 ميكرولتر من وسائط الخلايا. رج الطبق بلطف ، واضغط على جانبه لضمان تغطية الجزء السفلي بالكامل من البئر بالمحلول. بمجرد ملء جميع الآبار بالوسائط ، اضبط اللوحة على الجانب.

في هذه المرحلة ، استرجع مزرعة خلاياك من الحاضنة. سنقوم بإجراء بروتوكول ارتباط قوي. الغرض من هذا البروتوكول هو إنشاء تعليق من 50،000 خلية لكل ملليلتر.

قبل بذر الخلايا ، تأكد من إجهاد خلاياك مرة واحدة من خلال المصفاة ، من أجل تفتيت كتل الخلايا إلى خلايا مفردة ، ضع بعناية 500 ميكرولتر من محلول الخلية في كل بئر. بعد بذر الخلايا ، من المهم ترك الألواح تجلس لمدة ساعة حتى تتمكن الخلايا من الاستقرار مباشرة على الأنماط. بعد مرور ساعة ، ضع اللوحة في حاضنة بين عشية وضحاها.

يتكون الجزء الثاني من التجربة من إضافة الأدوية إلى صفيحة البئر 24 والتصوير الفلوري للصفيحة. بالنسبة لهذا الجزء من البروتوكول ، لدينا متطلبان مهمان لضمان بقاء الخلايا القوية واستجابتها. الأول هو أن التركيز النهائي ل DMSO في الآبار ذات الخلايا لا يزيد عن 1٪ مما يعني أننا بحاجة إلى إجراء تخفيف كامل 100 من مخزوناتنا الدوائية.

والثاني هو أننا لا نستطيع إضافة DMSO مباشرة إلى الآبار لأنه سوف يتحطم إلى أسفل هذا الخلط ، ثم يضر الخلايا ذات التركيز العالي المستوى. بدلا من ذلك ، يجب علينا إنشاء حل وسيط من دواء DMS0 والوسائط ، بحيث يمكننا مزجه معا تماما لتجنب التعرض المحلي العالي ل DSSO للخلايا. في هذا البروتوكول ، سنقوم بإجراء تخفيف ثماني مرات من ست خطوات يغطي نطاقا من 40 ميكرومولار وصولا إلى واحد نانو مولار إنشاء سلسلة تخفيف ثماني ثماني خطوات من ست خطوات عن طريق نقل 30 ميكرولتر من محلول الدواء المخزون إلى أحجام متتالية من 210 ميكرولتر من DMSO والخلط الدقيق بين كل خطوة نقل في تجربتنا ، سنقوم بتقييم تأثير blebbistatin.

على المثانة البشرية من خلال خلايا العضلات. من أجل تلبية كلا الشرطين ، سنقوم أولا بإنشاء دواء وسيط DMSO وحل إعلامي. وهذا يؤدي إلى تخفيف 16.7 أضعاف من DMSO.

ثم سنضيف هذا المحلول الدوائي الوسيط إلى خلايانا ، باستخدام نسب تنتج تخفيفا إضافيا بمقدار ستة أضعاف ، مما يؤدي إلى تخفيف إجمالي 100 كامل وتركيز نهائي بنسبة 1٪ DMSO لتحقيق ذلك ، لكل محلول دوائي مخزون ، امزج 30 ميكرولتر من الدواء في 470 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا ، ثم انقل 200 ميكرولتر من هذا المحلول الوسيط إلى البئر المناسب على لوحة 24 بئرا ، الذي يحتوي على 1000 ميكرولتر في كل بئر. ينتج عن ذلك بشكل جماعي تركيز نهائي بنسبة 1٪ من DMSO Incubate لفترة زمنية مناسبة. في تجربتنا ، نحتضن لمدة 30 دقيقة ، عندما تكون مستعدا للتصوير ، أضف بقعة نووية حية في جميع أنحاء آبارك ، أضف تخفيفا واحدا إلى 10،000 من المخزون.

اتركه يحتضن لمدة 15 دقيقة إضافية. عندما تكون مستعدا للتصوير، ستحتاج إلى مجهر فلورسنت مجهز لتصوير القنوات الفلورية لكل من نوى الخلايا المسماة وصبغة الفلورسنت. يتم تصنيف الأنماط الدقيقة التي في مثالنا هي قناة tri C.

الآن ، سنكون نوى blebbistatin تصوير الفلورسنت من أجل تحديد الخلايا المفردة ، تأكد من تصوير نوى الخلايا البقعة في نفس الموضع بالضبط كما ترى النمط الجزئي بحيث يمكن محاذاتها أثناء التحليل. قم بتحميل الصور التي تم الحصول عليها إلى جهاز الكمبيوتر الخاص بك ، تأكد من أن الصور يتم تصنيفها بشكل صحيح ، بحيث تنتهي قنوات النمط بتسطير PT. وتنتهي الصور في القناة النووية بتسطير دابي. الآن ، سنقوم بتحويل صور tif إلى صور PNG ، باستخدام الصورة J بمجرد فتح الصورة J ، يتم تحميلها في قناة واحدة في كل مرة.

سنقوم أولا بتحميل قناة النمط وضبط التباين ، من أجل زيادة الإشارة إلى أقصى حد ، وتقليل الخلفية. بالإضافة إلى ذلك ، سنقوم بتنعيم الصورة. بمجرد تعديل الصورة حسب رغبتنا ، سنقوم بعد ذلك بتغيير نوع الصورة إلى ثمانية بت.

ثم قم بتصدير الصورة كنوع PNG. ثم حدد المربع، واستخدم تسميات الشرائح كأسماء ملفات. إنشاء مجلد جديد يسمى PNGs.

ثم احفظ ملفات PNG هناك ، لتحليل الصور ، انتقل إلى Biodock dot الذكاء الاصطناعي ، وقم بإنشاء حساب واتصل بالمؤلفين للحصول على وصول مجاني إلى وحدة التحليل. قم بتسجيل الدخول بمجرد إنشاء حسابك. هنا ستتمكن من تحميل صور جديدة.

سنسمي هذه الدفعة الجديدة ، بيانات تجربة الويب JoVE. الآن ، يمكننا استيراد الصور عن طريق سحبها ثم إسقاطها ، والضغط على OK.At هذه النقطة ، وحدد بياناتك. ثم انقر فوق تحليل، مرر لأسفل إلى الوحدة النمطية المسماة تحليل الانقباض ثم اضغط على تحديد.

اضبط التكبير على نفس القيمة التي استخدمتها للتصوير بمجرد اكتمال البيانات ، انقر فوقها ثم يمكننا تحديد تنزيل البيانات. بمجرد تنزيل البيانات ، يمكننا بعد ذلك رؤية أزواج الصور المتراكبة لكل صورة تم إدخالها. لدينا أيضا إمكانية الوصول إلى إحصائية موجزة من شأنها أن تعطينا متوسط الانكماش لكل مجموعة من الخلايا.

وحدة قياس الانكماش بالبكسل. بالنظر إلى البيانات ، يمكننا أن نرى هنا أنه في الآبار المعالجة ب DMSO فقط ، كان هناك تقلص أعلى بكثير للخلايا مقارنة بتلك الخلايا التي عولجت ب blebbistatin. لدينا أيضا إمكانية الوصول إلى البيانات لكل نمط واحد ، تم اكتشافه في أي من الصور.

هذا يعطينا معلومات مفصلة فيما يتعلق بموقع الصورة ، وأصل الصورة ، ونوع الموضع ، وعدد الخلايا ، إما صفر واحد أو أكثر من واحد ، وحجم النمط الجزئي ، والانكماش المحسوب للخلايا. يتكون هذا الوضع من كل نمط محدد داخل اللوحة الصغيرة. كانت أنماط الخلايا المفردة من هذه القائمة متوسطة لحساب متوسط الانكماش لصورة PNG في الملف الآخر.

يمكنك فرز بيانات الخلية الواحدة وتحليلها حسب الحاجة لتجربتك. بالنسبة لهذا الجزء من الفيديو ، سنعرض بيانات تمثيلية يمكن جمعها من صفيحة من 24 بئرا تعرض بيانات الاستجابة هذه من خلايا العضلات الملساء في المثانة المعالجة بعقارين مختلفين. هذه صور للآبار المعالجة ب DMSO و blebbistatin على التوالي.

هنا ، يمكننا أن نرى أن الخلايا المعالجة باستخدام DMSO فقط ، تعرض عددا كبيرا من الأنماط الدقيقة التعاقدية ولكن الخلايا المعالجة ب blebbistatin كانت أكبر ومفتوحة لملاحظة أن هناك انكماشا أقل. تعرض البيانات الواردة في هذا الرسم البياني انقباض خلية التباين نتيجة للعلاجات المختلفة للخلايا. مركز توزيع الخلايا المعالجة بالبليبيستاتين أقل من مركز توزيع الخلايا التي عولجت باستخدام DMSO.

وهذا يتفق مع المعلومات المعروضة في الصور السابقة. لأن الخلايا التي عولجت ببليبيستاتين أظهرت انكماشا أصغر بكثير. هذا يدل على أن العلاج مع blebbistatin يريح الخلايا بشكل كبير.

تساهم كل مجموعة من مجموعات البيانات هذه في نقطة على منحنى استجابة الجرعة يمكن جمعها من صفيحة واحدة من 24 بئرا ، باتباع البروتوكولات الموضحة في الفيديو. هنا ، يمكننا أن نرى أن cytochalasin D أكثر فعالية من blebbistan كما هو موضح في القيم المنخفضة للانكماش ، بالنظر إلى تركيزات الدواء الأعلى. إذا كنت ترغب في توسيع نطاق تجاربك بشكل كبير ، يتوفر إصدار لوحة 384 جيدا ، ويمكن استخدام ذلك مع الأتمتة لتوسيع نطاق التجارب بشكل كبير.

يمكن جمع هذه البيانات من صفيحة بئر 384 ، بدلا من وجود ست خطوات تخفيف لكل دواء على لوحة البئر 24 ، تسمح لنا لوحة البئر 384 بإجراء 20 خطوة تخفيف لكل دواء مع نسخ متماثلة متعددة. تكنولوجيا رقاقات الثلج فريدة من نوعها. يسمح بتصور تقلص الخلية الواحدة باستخدام الفحص المجهري ، وهو أمر مستحيل حتى الآن.

لذلك ، تعتمد التكنولوجيا على شكل مقاييس منقوشة بالبروتين المسمى بالفلورسنت. النمط المنهجي هو تشكيل للانكماش الخلوي ويسمح بقياس دقيق لتعديل عقد النمط الظاهري بواسطة أي دواء معين. بالطبع ، لا تزال هذه التكنولوجيا قيد التطوير بنشاط للتطبيقات والعديد من مجالات الأمراض المختلفة ، مثل الربو وأمراض القلب والأوعية الدموية والأورام المناعية الالتهابية ، وبالطبع ، أي من مؤشرات مرضنا حيث يلعب الانكماش الخلوي غير الطبيعي دورا رئيسيا في تطور المرض.

كما نوضح هذه التكنولوجيا القائمة على النقش الجزئي لقياس انقباض الخلية ، فإنها توفر بديلا مبسطا للفحص المجهري التقليدي لقوة الجر ، مما يوفر تحليلا بديهيا ، ويراقب تقلص النمط ، ويوفر دقة خلية واحدة في مجموعات كبيرة من الخلايا. بعض الاعتبارات ، قد تشكل هذه الطريقة تحديات لاستخدام الخلايا التي تكون إما صغيرة جدا ، مثل الخلايا التائية والعدلات ، أو أنواع الخلايا التي لا تلتصق بها. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الخلايا التي ترتبط أسبوعيا ، أو ترتبط ببعضها البعض في الغالب أو التي لا تنتشر تماما ، لن تنتج إشارات انقباضية قابلة للقياس.

يجب على مستخدمي التكنولوجيا تقييم مختلف التركيبات المتوسطة المحتملة لزراعة الخلايا بعناية لنوع الخلية الخاص بهم. كمكونات مختلفة ، قد تؤدي عوامل النمو ومستويات المصل وحساسيات الأس الهيدروجيني إلى سلوكيات متغيرة. يجب أن يستمر تحسين البروتوكولات في توسيع نطاق أي سير عمل تجريبي.

في نهاية المطاف ، إذا لم تكن دقة الخلية الواحدة ضرورية ، أو إذا كان نوع الخلية المستهدفة لديه الحد الأدنى من القدرة على الانتشار ، فيمكن استخدام طرق الفحص المجهري التقليدية لقوة الجذب لمثل هذه التجارب. وإلا فإننا نأمل أن توفر هذه الأداة وسيلة إضافية لعلماء الأحياء الخلوية لدراسة الانكماش الخلوي وإجراء دراساتهم.