تحضير الجزر الجنينية المجمدة غير البشرية للرئيسيات لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى المشترك وتسلسل ATAC ، والأيض السائب
نوفمبر 8, 2024
يصف هذا البروتوكول إجراءات عزل النوى عالية الجودة من جزر البنكرياس الرئيسية غير البشرية المجمدة لاستخدامها في تسلسل الحمض النووي الريبي المتزامن أحادي النواة وتسلسل ATAC مع الحفاظ على الجزء الخلوي الأكبر للتحليلات الأيضية من نفس العينات.
نحن نستخدم نموذجا متعديا للغاية وغير بشري لتقييم كيفية تأثير النظام الغذائي للأمهات واستهلاك الأدوية أثناء الحمل على التطور الجنيني ووظيفة ما بعد الولادة لجزر البنكرياس في النسل. يمكن للتغييرات المبرمجة تنمويا أن تغير قابلية الإصابة بالأمراض في وقت لاحق من الحياة. يتمثل التحدي عند العمل مع عينات يصعب الحصول عليها مثل تلك المأخوذة من الرئيسيات غير البشرية في تقييم أسئلة متعددة من نفس الفرد بكفاءة.
لسوء الحظ ، قد يكون استخراج المعلومات في وقت واحد من المستقلب والجينوم أمرا صعبا بسبب عدم توافق كواشف الفحص في التدهور الحساس للوقت للجزيئات المراد قياسها كميا. يسمح بروتوكولنا باستقراء وفرة المستقلب ، وإمكانية الوصول إلى الكروماتين ، والتعبير الجيني التفاضلي من نفس المادة الأولية. يوفر هذا النهج متعدد الطبقات نظرة ثاقبة حول كيفية تغيير التمثيل الغذائي للجينوم في جزر البنكرياس.
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول طرق عزل نوى عالية الجودة من جزر بنكرياسية مجمدة لحيوانات رئيسية غير بشرية، وذلك لإجراء تسلسل RNA وتسلسل ATAC في آن واحد. كما يعمل البروتوكول على حفظ الجزء السيتوسولي الكلي لتحليلات الميتابولوميات، مما يتيح فهماً شاملاً للتفاعلات الأيضية والجينومية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء
- علم الأيض (الميتابولوميات)
خلفية علمية
- تُعد نماذج الرئيسيات غير البشرية ضرورية لدراسة آليات الأمراض البشرية.
- يمكن أن يؤثر النظام الغذائي للأم والأدوية على تطور الجزر البنكرياسية لدى النسل.
- يمثل التحليل المتزامن للميتابولوم والجينوم تحدياً بسبب تحلل العينات.
- تعالج هذه الدراسة الحاجة إلى تحليلات متعددة الطبقات وفعالة من عينات محدودة.
الغرض من الدراسة
- لتقييم تأثير العوامل الأمومية على تطور جزر البنكرياس الجنينية.
- لاستكشاف كيف يمكن للتغيرات الأيضية أن تؤثر على التعبير الجينومي.
- لتطوير بروتوكول يسمح بإجراء تحليل شامل من العينة نفسها.
الطرق المستخدمة
- عزل النوى من جزر البنكرياس.
- تسلسل RNA وتسلسل ATAC في آن واحد.
- الحفاظ على الأجزاء السيتوزولية لإجراء دراسات الميتابولوميات.
- تحليل متعدد الطبقات لتقييم وفرة الميتابوليتات والتعبير الجيني.
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح للنوى والكسور السيتوبلازمية عالية الجودة.
- رؤى حول كيفية تأثير النظام الغذائي للأم على وظيفة جزر البنكرياس.
- إثبات جدوى إجراء التحليلات الجينومية والميتابولومية في آن واحد.
- الكشف عن روابط محتملة بين التمثيل الغذائي والتعبير الجيني في الجزر.
الاستنتاجات
- يتيح هذا البروتوكول إجراء تحليل شامل للجزر البنكرياسية.
- قد تساهم النتائج في توجيه الدراسات المستقبلية حول القابلية للإصابة بالأمراض.
- يسلط الضوء على أهمية التأثيرات الأمومية على صحة النسل.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يعالج دمج تسلسل الحمض النووي الريبي للنواة المفردة (single-nucleus RNA-seq)، وتسلسل ATAC-seq، والتمثيل الغذائي الشامل (bulk metabolomics) من جزر البنكرياس المجمدة للرئيسيات غير البشرية عقبة حرجة في الاكتشافات متعددة الأوميكس باستخدام عينات نادرة أو ثمينة. يتيح هذا النهج توصيفاً جزيئياً شاملاً من مواد محدودة، مما يدعم الثقة التنبؤية في التحقق المبكر من الأهداف والحد من المخاطر الميكانيكية. يرفع هذا البروتوكول من عائد البيانات لكل عينة إلى الحد الأقصى، مما يوجه قرارات المحفظة البحثية المعدلة حسب المخاطر في أبحاث الأمراض الأيضية والتنموية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير الصيدلاني الحيوي
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يسمح باستقصاء الآليات الأيضية وفوق الجينية الكامنة وراء الهوية الخلوية في الأنظمة ذات الصلة بالأمراض.
- يدعم التحقق الوظيفي من الأهداف عن طريق ربط وفرة المستقلبات بالتعبير الجيني وإمكانية الوصول إلى الكروماتين.
- يسهل الحد من المخاطر الآلية من خلال دمج البيانات الجزيئية متعددة الطبقات من نفس المصدر البيولوجي.
الفحص وتطوير المقايسة
- يجهز كسور النوى والسيتوسول التي تم التحقق من صحتها لسير عمل التسلسل عالي الإنتاجية والميتابولوميات اللاحقة.
- يُحسن تكرارية المقايسة وتوحيدها القياسي من خلال تقليل تأثيرات الدفعة عبر الدراسات متعددة المجموعات.
- يتيح مخرجات كمية متعددة الأوميكس لتقييم قوي للمركبات أو الاضطرابات.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يربط القراءات الجزيئية بالمؤشرات الحيوية الأيضية والجينية الفوقية ذات الصلة بالمرض في النماذج الانتقالية.
- يدعم الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التحقق قبل السريري من خلال الاستفادة من أنظمة الرئيسيات غير البشرية.
- يوفر رؤى تنبؤية حول البرمجة التنموية وآليات القابلية للإصابة بالأمراض.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
يربط هذا البروتوكول بين مراحل الاكتشاف المبكر، والتحقق من الأهداف، والبحوث الانتقالية، وذلك من خلال تمكين التوصيف متعدد الأوميكس من عينات نسيجية نادرة.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بالتفاعلات بين التمثيل الغذائي والعوامل فوق الجينية في تطور الجزر البنكرياسية.
- الفحص: توفر تحضيرات متكررة للنوى والمستقلبات من أجل فحوصات أوميكس قابلة للتوسع.
- التحليلات: توفر بيانات كمية عن التعبير الجيني، وإمكانية الوصول إلى الكروماتين، ووفرة المستقلبات من أجل التحليلات المقارنة.
- الأبحاث الانتقالية: تربط النتائج الجزيئية بالأنماط الظاهرية ذات الصلة بالمرض في نماذج الرئيسيات غير البشرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تضع سير عمل قابلاً لإعادة الاستخدام لتحقيق أقصى قدر من استخراج البيانات من العينات المحدودة أو المؤرشفة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الميكانيكي في أبحاث المراحل المبكرة.
- القيمة التشغيلية: توحد تحضير العينات متعددة الأوميكس (multi-omic) وتقلل من تأثيرات الدفعات (batch effects).
- القيمة الاستراتيجية: تمكن من اتخاذ قرارات أكثر استنارة بشأن المضي قدماً أو التوقف، وتضمن الاستخدام الفعال لرأس المال في التعامل مع العينات النادرة.
- تأثير المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر لبرامج الأمراض الأيضية والنمائية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في عمليات عزل النوى، وتسلسل النواة الواحدة، وسير عمل الميتابولوميكس.
- يستلزم الوصول إلى بنية تحتية للتسلسل عالي الإنتاجية ومطيافية الكتلة.
- يقتضي توحيداً صارماً للمعايير بين الفرق للتحكم في تأثيرات الدفعات.
- قابل للتطبيق على أنواع أخرى من الأنسجة، ولكن قد يتطلب تحسيناً للبروتوكول لمصفوفات العينات المختلفة.
- تفرض ندرة العينات والحساسية تجاه التحلل قيوداً عملية على الإنتاجية والتوقيت.
