تحضير خراج الفطريات المدمج في حبة أجار لتلقيح الفئران ذات الكفاءة المناعية داخل القصبة الهوائية

نحن نعمل على تطوير نموذج فأر لخراجات الفطريات المزمنة وعدوى الرئة لاختبار فعالية المضادات الحيوية في الدراسات قبل السريرية. التحدي الأول هو التغلب على المقاومة الجوهرية للفئران لخراجات المتفطرة. التحدي الثاني هو توليد دفعة قابلة للتكرار من أجار يتغلب على البكتيريا المدمجة للعدوى داخل القصبة الهوائية. نريد مشاركة بروتوكول مفصل لتحضير أجار بيت والعدوى التي يمكن تنفيذها بسهولة من قبل مختبرات أخرى لاختبار أدوية جديدة على الفئران.

إن الإصابة ب agar تتغلب على البكتيريا المضمنة بدلا من البكتيريا الحرة ، تتغلب جزئيا على قدرة الفئران ذات الكفاءة المناعية على التخلص من العدوى تلقائيا. يوفر هذا النموذج أداة قوية قبل السريرية لتقييم المضادات الحيوية الجديدة ضد خراج المتفطرة ، مما يسهل اكتشاف وتطوير المضادات الحيوية التي تشتد الحاجة إليها ضد الالتهابات الرئوية.

[مدرب] للبدء ، احصل على مزارع تعليق الفطريات الخراجية المتنامية بشكل كبير معدلة إلى كثافة بصرية تبلغ 30. انقل 27 مل من مثقاب الصويا ثلاثي القطع المنصهر المتوازن مسبقا عند 50 درجة مئوية إلى أنبوب يحتوي على ثلاثة ملليلتر من المعلق البكتيري. امزج التعليق عن طريق سحب العينات. ماصة خليط مثقاب البكتيريا بعناية في قارورة تحتوي على 60 مل من الزيت المعدني في قارورة. ضع القارورة في وعاء ثانوي وابدأ على الفور في التقليب بسرعة متوسطة على تحريك مغناطيسي باستخدام قضيب تقليب مغناطيسي. تأكد من تشكل دوامة مرئية في خليط مثقاب الزيت واستمر في التقليب لمدة ست دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع الثلج في الحاوية الثانوية للسماح للتعليق بالتبريد. ثم انقل خليط الملاط إلى أنابيب طرد مركزي سعة 250 مل. قم بالطرد المركزي للتعليق عند 3,700 جم لمدة ست دقائق عند أربع درجات مئوية للدورات الخمس الأولى ، وأعد تعليق حبيبات حبة المثقاب باستخدام DPBS. أيضا ، قم بتجميع مصفاة خلية قمع وحلقة موصل وأنبوب سعة 50 مليلتر في وحدة واحدة. بعد الغسيل العاشر ، قم بتعليق الحبيبات وتخفيف تعليق الخرزة أربع مرات. أضف مادة العينة المخففة إلى المصفاة لتصفية تعليق الخرزة. ببطء ، اسحب مكبس حقنة 30 مليلتر متصلة بحلقة الموصل لإنشاء شفط وتعزيز الترشيح. ثم قم بالطرد المركزي للتعليق المخفف عند 1000 جم لمدة دقيقتين لتركيزه. بعد سحب حبيبات الخرز في أنبوب سعة 50 ملليلتر ، قم بتخزينها عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد ، ولكن قم بإعداد حبات طازجة لكل دفعة من التجارب. للبدء ، قم بتقييد فئران CD One المخدرة باستخدام حامل ثلاثي الأبعاد مصمم خصيصا ومطبوع مائل. قم بتأمين الماوس من القواطع باستخدام خيط خياطة متصلة بالقضيب المركزي للحامل. وضع الفأر في وضعية استلقاء بطني مع رفع رأسه. قم بتوصيل إبرة تغذية معدنية عيار 24 بحقنة زجاجية مملوءة بتعليق حبة مثقاب الميكوبكتيريا. ضع مشابك أو سدادات من النايلون على المكبس لضمان ضبط حجم اللقاح البالغ 50 ميكرولتر لكل ماوس. الآن ، ضع إبرة التزقيم المعدنية عموديا فوق الماوس. أدخل الإبرة بعناية في الأعلى وحركها لأسفل في القصبة الهوائية. قم بإزالة مشبك النايلون أو السدادة وقم بتوزيع 50 ميكرولترا ببطء من معلق حبة المثقاب الفطرية في الرئتين. دع الماوس يرتاح لمدة خمس دقائق. ثم كرر إجراء التلقيح مرة ثانية لضمان ترسب عميق وقابل للتكرار لللقاح الكامل في الرئتين. عبرت حبات المثقاب التي تحتوي على خراج الفطريات عن بروتين الفلورسنت الأحمر الكرز ويختلف حجمها من حوالي 70 إلى 250 ميكرومتر. أظهر العبء البكتيري عبر ستة مستحضرات حبة مستقلة قابلية عالية للتكاثر. لم يظهر تعداد البكتيريا قبل وبعد المرور عبر المحقنة الزجاجية أي خسارة كبيرة في العبء البكتيري. كانت طريقة التلقيح بين القصبة الهوائية قابلة للتكرار عبر ثلاثة مستحضرات حبة مستقلة كما هو موضح في أعداد CFU للرئة في 24 ساعة بعد الإصابة. تم تأكيد قابلية تكرار العدوى بين ثلاثة مشغلين مستقلين حيث ظلت أعداد CFU في الرئة في 24 ساعة بعد الإصابة ثابتة عبر جميع المجموعات.