التصوير ثلاثي الأبعاد للأنسجة الحاملة للورم باستخدام التبييض التكراري يمتد إلى نهج تعدد الإرسال

يركز هذا البحث على تحديد أهداف الأدوية المعدلة للمناعة وأورام الجهاز الهضمي الصلبة المعقدة. يعد تحليل المشهد الخلوي للبيئة المكروية للورم أمرا بالغ الأهمية لفهم القابلية للإصابة بعلاجات مثل العلاج المناعي. يساعد التسلسل أحادي الخلية وقياس التدفق الخلوي في توصيف البيئة المكروية للورم ، ولكنه يفتقر إلى السياق المكاني. في الآونة الأخيرة ، ظهرت منصات التصوير والنسخ المتعددة لدراسة البيئة المكروية للورم في سياقها الحي.

تقتصر تقنيات تعدد الإرسال المتاحة لتحليل البيئة المكروية للورم ، سواء كانت متكررة أو كلها في واحد ، على بعدين. يوسع هذا البروتوكول التوصيف إلى بعد العمق ، مما يوفر رؤى تتجاوز FFPE الفردي أو الأقسام المجمدة.

[الراوي] للبدء ، انقل صفائح المناديل إلى كوب عينة يحتوي على وسط حصاد دافئ وضعه على طبق تسخين على طاولة التحضير. قم بتركيب الأنسجة على منصات في صفيحة طولها 15 سم تحتوي على وسط حصاد. قم بلف الأنسجة الحاملة للورم بعناية بحيث يكون الجانب الظهاري المتوسط متجها لأعلى فوق جانب الفتحة الصغير من المنصة وقم بتثبيته بخياطة حريرية 2-0. ضع منصة الأنسجة المحضرة مغمورة بالكامل عكسيا في صفيحة من 24 بئرا تحتوي على وسط حصاد. للتثبيت ، أضف 10 مل من المخزون المثبت إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر يحتوي على 30 مل من PBS البارد لتحضير 40 مل من مخزن التثبيت. باستخدام الملقط ، انقل الأنسجة المثبتة على المنصات إلى مخزن التثبيت. وتحتضن لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية. صب المثبت. استبدله ب 40 مل من PBS البارد. واحتضن لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. للتلوين ، أضف 1 مليلتر من المخزن المؤقت في البئر وأدخل منصة الأنسجة. قم بالحظر لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة على كرسي هزاز مضبوطة على سرعة منخفضة تبلغ 30 دورة في الدقيقة. قم بإعداد 0.8 مل من محلول صبغة الأجسام المضادة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق وجهاز الطرد المركزي عند 10,000 جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. انقل 0.75 مل من المادة الطافية إلى بئر نظيف من لوحة حضانة 9 آبار. وأدخل منصة مغسولة. لف اللوحة بورق الألمنيوم. واحتضان لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة على هزاز مضبوطة على سرعة منخفضة تبلغ 30 دورة في الدقيقة. اغسل المنصة في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر يحتوي على 40 مل من PBS لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. أضف 0.1 مل من PBS إلى وسط القاع الزجاجي لطبق تصوير يبلغ طوله 3.5 سم ، واتركه جانبا. قم بربط حلقة ضبط الارتفاع بشكل غير محكم في اتجاه عقارب الساعة في الغطاء الخارجي. وقم بتركيب المنصة في الحامل البلاستيكي الداخلي ، مما يضمن محاذاة أخدود الشق. قم بتأمين النظام الأساسي باستخدام شريط التمرير. ضع محول التصوير المجمع على الطبق السفلي الزجاجي وقم بخفض حلقة ضبط الارتفاع بعناية حتى تلامس الأنسجة المخزن المؤقت. بمجرد الوصول إلى المسافة المثلى من الزجاج ، أضف 0.2 مل من PBS على الأنسجة مع الجانب السفلي لأعلى لمنع جفاف الأنسجة أثناء التصوير. ابدأ برنامج الحصول على الصور. حدد الهدف المناسب، مثل 20X أو 40X، وأضف وسيط الغمر المقابل. اختر معلمات الحصول على الصور ، مثل سرعة المسح الضوئي البالغة 600 هرتز ، ودقة XY تبلغ 1024 × 1024 بكسل ، والمتوسطات المكونة من ثلاثة أسطر ، والمسح الضوئي ثنائي الاتجاه. حدد خطوط الليزر المناسبة أو اضبط ليزر الضوء الأبيض ليتناسب مع أطياف الإثارة والانبعاث للفلوروفورات المستخدمة في التلوين. ضع طبق التصوير المجمع في حامل العينة على مرحلة المجهر. قم بتوسيط العينة باستخدام عنصر التحكم XY ، وقم بإحضار الهدف إلى زجاج الغطاء ، وابدأ في الحصول على الصورة. بعد كل جولة تصوير ، قم بإجراء خطوة تبييض. تحضير 5 ملليلتر من محلول بوروهيدريد الليثيوم 1.5 ملليغرام لكل مليلتر في الماء المقطر ، واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. انقل 1 مليلتر من محلول بوروهيدريد الليثيوم إلى بئر نظيف من لوحة الحضانة المكونة من 9 آبار وأدخل المنصة المغسولة لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل المنصة لفترة وجيزة في 20 مل من PBS داخل أنبوب مخروطي الشكل. تحقق من إشارة الفلورسنت المتبقية باستخدام أعلى إعداد ليزر لتعويض Z. تظهر هنا عينة بريتونية حاملة للورم ملطخة بالجولة الأولى من التبييض التكراري تعدد الإرسال ، أو لوحة IBEX 1 للتصور. تم تحديد آفات الورم على أنها هياكل شبيهة بالوردة كانت إيجابية مزدوجة ل CD44 و podoplanin مع الترتيبات النووية المميزة لورم الظهارة المتوسطة الحليمي. تظهر هنا صور التألق المناعي عالية الدقة لمناطق مختارة من العينة البريتونية الحاملة للورم. تكشف هذه الصور عن مناطق الورم وواجهات البنية اللمفاوية الثلاثية للورم ، مما يسلط الضوء على تسلل الخلايا المناعية المتسق بكثافة عالية من الخلايا الإيجابية CD45. يعرض هذا الشكل تلطيخ التألق المناعي التكراري عبر دورات IBEX من واحد إلى ست ، موضحا التوزيع المكاني للعلامات المناعية والهيكلية داخل آفة الورم وواجهة البنية اللمفاوية الثلاثية للورم. يتم عرض الحد الأقصى من الإسقاطات للأقسام البصرية المختلفة هنا. أكد هذا التصوير ثلاثي الأبعاد أن آفات الورم والهياكل اللمفاوية الثلاثية موجودة في أعماق Z مختلفة ، مما يدل على قيود التصوير ثنائي الأبعاد في التقاط بنية الأنسجة المعقدة.