الفصل والتوصيف التفاضلي للحويصلات الميكروبية خارج الخلية في الفئران الحساسة للملح في ظل ظروف النظام الغذائي عالي الملح

يستكشف هذا البحث دور الحويصلات الميكروبية خارج الخلية في الأمعاء في الفئران المصابة بارتفاع ضغط الدم الحساسة للملح في نظام غذائي عالي الملح ، ويدرس كيف يغير النظام الغذائي الغني بالملح الحويصلات ويؤثر على تفاعلات ارتفاع ضغط الدم والمناعة. تشمل التطورات الحديثة في هذا المجال فهم دور الحويصلات الميكروبية خارج الخلية في الأمعاء في ارتفاع ضغط الدم ، وتقييم تأثير الأنظمة الغذائية الغنية بالملح على التنوع الميكروبي وتنفيذ التدخلات النباتية التي تستهدف الحويصلات من تنظيم التمثيل الغذائي والمناعة. تشمل التحديات التجريبية الحالية عزل الحويصلات خارج الخلية ذات الأولوية العالية ، وتمييز الحويصلات المشتقة أيضا عن حويصلات الميكروبيوم ، وتقليل فقدان العينة في بروتوكولات الصباغة القياسية لضمان قابلية التكاثر عبر الدراسات. توفر شبكة الكثافة وبروتوكول الطرد المركزي أولوية أعلى للحويصلات خارج الخلية مع تحسين السلامة والتكاثر مقارنة بالطرق التقليدية ، مما يتيح أبحاث حوصلة ميكروبيوم الأمعاء خارج الخلية بشكل أكثر موثوقية في دراسات ارتفاع ضغط الدم.

[الراوي] للبدء ، انقل خمسة جرامات من البراز إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر يزن مسبقا. أضف 50 مل من PBS الخالي من السموم الداخلية المسخن مسبقا بزاوية 37 درجة مئوية إلى الأنبوب وقم بتدوير الأنبوب لمدة 30 دقيقة. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي عالي السرعة إلى 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، ضع العينة بشكل متماثل في جهاز الطرد المركزي وقم بالدوران عند 8,000 جرام لمدة 15 دقيقة. بعد الطرد المركزي ، قم بشفط المادة الطافية ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي معقم جديد. بعد الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 15 دقيقة ، قم بشفط المادة الطافية بعناية واستخدمها لمزيد من التحليل. ضع وحدة تصفية معقمة 0.22 ميكرومتر على الثلج. انقل المادة الطافية إلى الجزء العلوي من الفلتر وقم بتشغيل مضخة التفريغ لجمع العينات المفلترة. انقل المرشح إلى مرشح طرد مركزي بقطع 10 كيلو دالتون وسعة 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية 3000 جم لمدة 30 دقيقة لتركيز العينة على 1,400 ميكرولتر على الأقل. ضع العينة على الفور على الجليد. امزج حجما واحدا من المخزن المؤقت المتدرج A مع خمسة أحجام من وسط تدرج الكثافة لتحضير محلول العمل. قم بإعداد محلول يوديكسانول بنسبة 10٪ عن طريق خلط وحدة واحدة من محلول العمل مع أربع وحدات من المخزن المؤقت B. وبالمثل ، قم بخلط وحدتين من محلول العمل مع ثلاث وحدات من المخزن المؤقت B لمحلول يوديكسانول بنسبة 20٪ وأربع وحدات من محلول العمل مع وحدة واحدة من المخزن المؤقت B لمحلول يوديكسانول بنسبة 40٪. الآن امزج العينة المركزة المحضرة مسبقا مع سبعة ملليلتر من وسط تدرج الكثافة لعمل محلول يوديكسانول بنسبة 50٪. لتحضير تدرج الكثافة ، أضف محلول التريبان الأزرق إلى محاليل اليوديكسانول بنسبة 40٪ و 10٪. انقل ثمانية ملليلتر من محلول اليوديكسانول بنسبة 50٪ إلى قاع أنبوب طرد مركزي من مادة البولي بروبيلين ذات الجدار الرقيق. قم بإمالة الأنبوب إلى 70 درجة وانقل ثمانية ملليلتر من محلول اليوديكسانول بنسبة 40٪ إلى سطح السائل. بعد ذلك ، أضف ثمانية ملليلتر من محلول اليوديكسانول بنسبة 20٪ ، متبوعا بسبعة ملليلتر من محلول اليوديكسانول بنسبة 10٪ ومليلترين من PBS الخالي من السموم الداخلية. خذ أنبوب تدرج الكثافة المحضر وضعه في جهاز طرد مركزي فائق المبرد مسبقا. اضبط معلمات الطرد المركزي الفائق على 100,000G 20 ساعة و 10 درجات مئوية وابدأ التشغيل. لفصل كثافة التدرج اليدوي للمجموعة ، يبلغ تدرج الكثافة حوالي 34 مل من السائل. يتم استخراج ملليلترين من المحلول ببطء من مركز سطح السائل ، وكل محلول ملليلتر هو تدرج. إذن ينقسم محلول تدرج الكثافة إلى 17 تدرجا. أخيرا ، باستخدام ماصة ، انقل كسور الكثافة إلى أنابيب عينة معقمة ووضعها على الفور على الجليد. كشف تحليل تتبع الجسيمات النانوية عن حجم وتوزيع وتركيز الحويصلات خارج الخلية التي تم جمعها من كسور تدرج الكثافة المختلفة. تركزت غالبية الحويصلات خارج الخلية عبر جميع الكسور ضمن نطاق حجم 30 إلى 100 نانومتر باتباع نمط توزيع نموذجي. وصل تركيز الحويصلات خارج الخلية إلى أعلى مستوى له في الجزء التاسع ، وبلغ ذروته عند حوالي 3.85 في 10 إلى قوة تسعة جسيمات لكل مليلتر. كان محتوى البروتين ، الذي تم قياسه باستخدام مجموعة حمض البيسنكونينيك ، أعلى أيضا في الجزء التاسع عند 0.417 ميكروغرام لكل ميكرولتر. بالإضافة إلى ذلك ، ارتفعت مستويات التعبير عن عديدات السكاريد الدهنية ، التي تم تحديدها باستخدام مجموعة أدوات الكشف عن السموم الداخلية ، بشكل ملحوظ في الكسرين التاسع و 10. كما لوحظت كميات أكبر من البروتين في الجزء التاسع أثناء تحليل الرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل الصوديوم بولي أكريلاميد. كشف المجهر الإلكتروني للإرسال ، أو صور TEM ، عن الحويصلات خارج الخلية التي تمتلكها مورفولوجيا شبيهة بالغشاء الدائري.