细菌转化

背景

在 20^世纪初，肺炎占传染病死亡人数的很大一部分¹。为了开发有效的肺炎疫苗，弗雷德里克·格里菲斯 （Frederick Griffith） 着手研究肺炎链球菌的两种不同菌株:一种外观粗糙的非毒力菌株（R 菌株）和一种外观光滑的毒力菌株（S 菌株），由于外部多糖胶囊²。S 菌株的这一外层使它们能够承受宿主的免疫系统，最终导致危及生命的疾病。当 Griffith 分别给小鼠注射任一菌株的热灭活细菌时，老鼠活了下来。然而，当他给小鼠注射热灭活的 S 菌株和活的 R 菌株的组合时，小鼠死亡²。当他分析从注射该组合的死小鼠中获得的样本时，他观察到存在活的 S 菌株细菌。1928 年，格里菲斯指出，必须发生一个"转化"过程才能将非毒力细菌转变为毒力菌株。作为已知的细菌转化的第一个发现，他的发现为基因工程中一个重要工具——转化³ 的开发铺平了道路。

转化是由于从环境中摄入 DNA 而导致的细胞遗传变化。在 Griffith 的实验中，编码 S 菌株保护性多糖涂层的 DNA 没有因热休克而分解并被引入 R 菌株中，使后者能够绕过小鼠的免疫系统。虽然这个过程在野外生物甚至不同物种之间不断发生，但科学家们在实验室环境中转化细菌用于研究目的⁴。

使用质粒进行细菌转化

细菌是理想的转化生物体，因为它们可以很容易地将外源遗传物质吸收到基因组中并迅速扩增^3,5。它们在细胞质内有一条环状染色体和多个称为质粒的双链 DNA 小环状片段。这些质粒可以独立于染色体 DNA 进行复制，并且通常具有一定的功能益处，例如对抗生素的耐药性^6,7。在自然环境中，细菌通过从其他细菌中摄取质粒来进行"细菌转化"，这个过程称为共轭⁸。此外，当它们繁殖时，它们的每个后代都会收到一份新质粒的拷贝。

用于实验目的的质粒称为质粒载体。在实验室环境中，科学家可以通过将 DNA 片段插入质粒载体中，人工制备长度约为 5,000-10,000 个碱基对的"重组质粒"。这些重组质粒通常具有某些组分:复制起点 （ORI）、抗生素抗性基因、多克隆位点、启动子、选择标记和目标基因。复制的起点是复制开始的地方。抗生素抗性基因允许摄入质粒的细菌在某种抗生素药物存在下在平板上存活。尽管质粒是相对较小的 DNA 片段，但科学家需要处理宿主细胞以使质粒能够穿透细胞膜。因此，转化效率与主膜的孔隙率直接相关。 一种常见的方法是对用氯化钙溶液处理过的细菌进行热休克⁹。未掺入质粒的细菌不会转化，因此没有抵抗力在平板上存活并可见。多个克隆位点通过包含限制性内切酶位点来切割可以插入和连接目标基因的质粒，从而帮助 DNA 插入。启动子驱动目标基因的转录。它由标记物标记，通常是荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白 （GFP），或者可以是额外的抗生素耐药基因。抗生素抗性基因和其他选择标记有助于我们确定收集的细菌是否含有目标质粒。

应用

有效的转化方法使科学家能够分离和剖析基因和基因产物，并导致生命科学和医学的许多进步，例如有效药物的开发、转基因作物的产生和先进的诊断工具¹⁰。 此外，随着技术的进步，新的转型方法已经出现。例如，Gateway 克隆允许将多个 DNA 片段插入不同的载体中，并在质粒¹¹ 之间转移 DNA 序列。此外，成簇的规则间隔短回文重复序列 （CRISPR）-Cas9 是一种基因编辑技术，可直接修饰基因组中的核苷酸，不需要使用质粒¹²。转化后，研究人员通常会分离和分析目标基因及其产物。随后，基因克隆的整个过程开辟了基因作的新领域。多亏了基因克隆，研究人员可以纵细菌产生大量特定的人类蛋白质，例如胰岛素来治疗糖尿病患者¹⁰。克隆在现代农业中也发挥了重要作用。转基因生物 （GMO） 是基因克隆和细菌转化的直接结果¹⁰。例如，科学家们正在努力生产将固氮基因纳入其基因组的转基因作物，以促进粮食生产并减少肥料的使用，从而减少肥料对经济和环境的影响¹³。总之，细菌转化是现代生物技术的第一步，也是未来研究发现的基础。

引用

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早在 20 世纪初，一位名叫弗雷德里克·格里菲斯 （Frederick Griffith） 的英国细菌学家正在研究引起肺炎的细菌 肺炎链球菌。他使用两种不同的菌株进行了一个简单的实验。一种菌株被称为 S 菌株，因为它的保护性胶囊使它形成的菌落或团块看起来光滑，也使其具有毒性或有害性。第二种是 R 菌株，一种缺乏保护性胶囊的细菌版本，使菌落外观粗糙，使其无毒。

首先，格里菲斯取了一些 S 菌株细菌并对其进行加热，产生了 S 菌株的热灭活版本。然后，他收集了一些老鼠，将它们分为四组。他给第一组注射了毒力强的 S 菌株，给第二组注射了无毒力的 R 菌株。他给第三组注射了热灭活的 S 菌株，最后，将热灭活的 S 菌株和 R 菌株混合在一起，并将这种混合物注射到第四组中。不出所料，第一组的老鼠死了，第二组和第三组的老鼠活了下来。但令 Griffith 惊讶的是，最后一组的老鼠也死了。

当他在 1928 年发表他的研究时，他将这种神秘的过程转变称为 Turning，因为他推测存在一个潜在的转变原理，这使得以前无毒力的菌株变得致命。后来，在 1943 年，Avert、MacLeod 和 McCarty 报告说，这种转化原理可能是去氧核糖核酸或 DNA，我们现在知道它是遗传材料。从本质上讲，格里菲斯的实验中发生的事情是，当细菌结合时，一些 DNA 从热灭活的 S 菌株泄漏到 R 菌株细胞中，转化这些无毒力的细菌并传递信息以制造保护胶囊，将 R 菌株变成有毒菌株，现在能够杀死第四组中的动物。

快进到今天，科学家们已经开发出一种更简单的方法来研究细菌转化，使用细菌 大肠杆菌 和称为质粒的小环状 DNA 环。通常，转化实验中使用的质粒包括具有特殊功能的基因，例如抗生素耐药性。大肠杆菌 是极好的转化对象，因为它们可以表现出一种叫做能力的特性，即从环境中吸收 DNA 的能力。从本质上讲，这意味着在某些环境条件下，如化学物质或电或热冲击，大肠杆菌的细胞壁可以暂时变得具有渗透性，并允许从环境中摄取DNA。一旦质粒进入 大肠杆菌 内，它就可以挂在新宿主细胞的细胞质中，并与基因组一起几代复制和表达，或者它可能完全整合到宿主的基因组中。如果细菌在任何时候丢失了质粒，细胞也会失去其抗生素耐药性，因此科学家在含有抗生素的培养基中培养细菌，以确保唯一幸存者是那些含有目标质粒的细菌。

在本实验中，您将学习如何使用含有抗生素抗性基因的质粒转化 大肠杆菌 细胞，同时练习无菌微生物学技术。