本报告以可视化方式展示了在生理剪切应力条件下研究白细胞与内皮细胞相互作用的平行板流动腔分析方法。该方法特别适用于研究内皮细胞选择素（E-选择素）及其白细胞配体在介导白细胞沿内皮细胞表面滚动过程中的作用。
本文内容
摘要
摘要
E-选择素是一种表达于微血管内皮细胞上的Ⅰ型跨膜蛋白，可启动循环白细胞向皮肤、骨骼及炎症组织的募集。E-选择素在皮肤和骨骼微血管上呈组成性表达，并可在炎症组织的微血管中由促炎性细胞因子（如IL-1α和TNF-α）诱导表达。这种凝集素受体与循环白细胞表面的碳水化合物配体发生弱结合相互作用，从而介导特征性的“滚动”行为。由于这些相互作用发生在更稳定的黏附事件和穿出（diapedesis）活动之前，因此白细胞滚动行为的表征及其E-选择素配体的鉴定，一直是白细胞迁移与炎症研究以及抗炎治疗药物开发中的重要目标（1-5）。本报告旨在提供一种在生理血流条件下研究E-选择素与E-选择素配体相互作用的最广泛应用技术的可视化、综合性描述。本实验室联合哈佛皮肤疾病研究中心，采用先进的平行板流动腔装置，结合数字成像系统和新型记录软件NIS-Elements，进行实验分析。该技术使我们能够实时分析黏附事件，实现屏幕可视化，并以视频形式记录滚动行为。白细胞黏附参数（如滚动频率、剪切抗性以及结合/锚定效率）通过NIS-Elements软件计算后导出至Excel电子表格，并进行统计学分析。在本演示中，我们利用平行板流动腔系统，在活的人骨髓微血管内皮细胞（hBMEC）上研究E-选择素依赖性的白细胞滚动活动。实验中采用表达高水平E-选择素配体的人造血祖细胞KG1a作为白细胞模型，而永生化的人骨髓内皮细胞系HBMEC-60则作为内皮细胞模型（6）。为在流动腔中诱导并模拟天然E-选择素的表达，HBMEC-60细胞首先经IL-1α激活处理。我们的视频展示结果表明，平行板流动分析是研究生理条件下E-选择素介导的白细胞滚动活动的适宜方法，且通过蛋白酶或糖苷酶消化处理，可在流动腔系统中实现对白细胞E-选择素配体功能特性的鉴定。
方案
1. 在培养皿中制备用于流动室实验的 hBMEC（HBMEC-60 细胞）单层
- 在4°C下过夜或在37°C下孵育3小时，用2 ml浓度为20 µg/ml的纤连蛋白（溶于PBS）包被35 × 10 mm组织培养皿。
- 吸除培养皿中的纤连蛋白溶液，并向其中加入1.5 × 105个HBMEC-60细胞[含HEPES和谷氨酰胺的Medium 199，10%胎牛血清，10%人血清，5单位/ml肝素，1 ng/ml重组人成纤维细胞生长因子，1%青霉素-链霉素]，使其生长至>90%融合度。（此过程需2天）
- 吸除生长培养基，为上调E-选择素表达，加入含50 ng/mL IL-1β的新鲜培养基，孵育4–6小时。此时细胞单层已准备好用于滚动实验。如需阻断E-选择素功能，可在37°C下加入终浓度为20 µg/ml的中和性抗人E-选择素单克隆抗体（克隆号BBIG-E4(5D11)），孵育约1小时。
2. 流式细胞仪用人类造血祖细胞KG1a的制备
- 将人造血祖细胞KG1a在含谷氨酰胺、10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基中培养至汇合状态（1×106 个细胞/mL），直接从培养瓶中吸取细胞用于流式腔实验。
- 使用血细胞计数板计算细胞数量，然后将细胞重悬于含10 mM HEPES（H/H缓冲液）和2 mM CaCl2的HBSS中，浓度为1×106 个细胞/mL。
- 细胞在冰上保存，直至用于实验。
3. 显微镜、平行板流动小室和注射泵的准备（图1）
图1. 平行板流动腔分析示意图。倒置显微镜、哈佛注射泵、计算机/相机和平行板流动腔以最佳方式排列，以实现高效且可重复的细胞分析。
- 打开倒置显微镜的电源和光源，启动注射泵电源，并在显微镜上选择10X物镜。
- 将50 mL锥形管放入支架中，并加入H/H缓冲液和2 mM CaCl2。
- 将5 mL塑料试管放入位于50 mL锥形管下方的试管架中。
- 将60 mL注射器放入注射泵中（确保注射器的活塞和筒身均固定牢固）。
- 将三通阀连接到60 mL注射器末端，并将5 mL注射器连接到三通阀上。
- 将平行流动腔装置（GlycoTech, Inc.）放置在显微镜载物台上，进液管朝右，出液管朝左，真空管朝后。
- 将真空管路连接至真空源，打开通气阀，使平行板装置吸附在载物台上（用于检测流动腔的真空密封裙边是否气密）。随后关闭通气阀。
- 将出液管路（显微镜左侧）连接至三通阀。此时装置已准备就绪，可进行HBMEC-60单层细胞板的安装。
- 取出HBMEC-60单层细胞板，并将其置于显微镜载物台中央。
- 开启真空，将流动腔装置置于细胞板上方，使单层细胞板位于装置中央。
- 轻柔地将流动腔装置下压至HBMEC-60单层细胞板上，使其在负压作用下牢固吸附（不应有气体泄漏的声音；此时可能需要对装置施加一定压力，以压缩橡胶垫圈）。
- 真空建立后，将进液管（右侧）插入盛有含2 mM CaCl2的H/H缓冲液的50 mL锥形管中。
- 打开三通阀，使液体流入60 mL注射器，并将泵设置为“泵送模式”。
- 为在不扰动细胞板上细胞的情况下排出进/出液管路中的空气，先将注射泵设为2 mL/分钟以填充进液管，待液体即将到达装置前，迅速调至0.5 mL/分钟。必须仔细完成系统预充，避免产生气泡，否则气泡可能导致单层细胞从板上剥离。
- 当观察到液体进入60 mL注射器时，表明流动腔和注射泵已完成预充，流动腔装置已准备就绪，可供使用。每次细胞进样运行及更换新板时均需重复此操作流程。
4. 使用 NIS Elements 捕获白细胞滚动事件
- 在桌面上打开 NIS Elements 软件。
- 点击“播放”图标以获取实时图像。目前使用自动曝光有助于更清晰地观察培养板，且对聚焦至关重要。
- 确保显微镜已正确聚焦在细胞单层上。
- 聚焦完成后，将曝光重设为每秒1帧，并调节显微镜光源。此时图像应显示在计算机屏幕上，由于光照水平较低，显微镜目镜中将不再可见图像。随后可调整光强直方图，以消除背景曝光或提高细胞清晰度。
- 点击“2X2 bin”或“Live Bin”，以获得适合视频采集的理想图像。
- 在菜单栏中点击“Macro”，然后选择“write to port”；选择端口“com3”并点击“open”。（此操作将打开端口，以便与注射泵协调工作。）
- 将1 mL KG1a细胞悬液移液至靠近进样管路的5 mL试管中，然后将进样管路末端插入试管底部。
- 进入菜单栏，点击“Capture”（采集），然后选择“time-lapse acquisition”（延时成像）。
- 新菜单将弹出。选择持续时间为210秒的程序，该时长对应KG1a细胞在HBMEC-60细胞上滚动的实验流程。（每个阶段均设定为在泵程序运行期间每秒拍摄一张图像。同时系统将通过com3端口发送指令以启动泵。）若延时成像过程中断，泵不会自动停止，必须手动重置。点击“Cancel”可返回实时图像模式。
- 根据操作手册，将注射泵设置为“Program Mode”（程序模式）。（程序模式允许手动设定特定流速（即剪切应力水平），以在腔室内施加相应剪切力，并调控KG1a细胞与HBMEC-60细胞单层之间的相互作用。）KG1a细胞在hBMEC细胞上滚动的实验条件如下：4.2 dynes/cm2 持续45秒，0.3 dynes/cm2 持续60秒，随后每15秒逐步递增，直至最大值4.2 dynes/cm2。
- 腔室内的壁面剪切应力（Wst）根据以下公式计算：Wst = 6µQ/a2b，其中μ为培养基估计黏度（0.0076 P），Q为体积流速（mL/s），a为通道高度（垫片厚度，cm，0.03 cm），b为通道宽度（cm，0.5 cm）。流速通过注射泵的程序模式进行调控。
- 显微镜与计算机现已准备就绪，可开始采集延时图像。在计算机上点击“start run”以开始数据采集。运行程序期间，务必向盛有KG1a细胞的试管中补充培养基，以确保进样/出样管路始终充满培养基（确保无气泡产生）。
5. 终末唾液酸化及表面糖蛋白对KG1a细胞E-选择素介导的滚动的影响（图2；视频片段5.1-5.5）
- 检测KG1a细胞在未刺激的HBMEC-60细胞上的滚动。（阴性对照） 按照上述方法制备KG1a细胞，并将其注入流动腔室，流经活的未经IL-1β刺激的HBMEC-60细胞。
- 检测KG1a细胞在经IL-1β预处理的HBMEC-60细胞上的滚动。（E-选择素依赖性对照） 按照上述方法制备KG1a细胞，并将其注入流动腔室，流经活的经IL-1β刺激的HBMEC-60细胞。
- 检测KG1a细胞在经IL-1β预处理并随后用中和性抗人E-选择素单克隆抗体处理的HBMEC-60细胞上的滚动。（E-选择素依赖性对照） 按照上述方法，将经中和性抗人E-选择素单克隆抗体预处理的活的IL-1β刺激的HBMEC-60细胞，用于KG1a细胞的灌注实验。
- 检测经唾液酸酶消化的KG1a细胞在IL-1β刺激的HBMEC-60细胞上的滚动。将KG1a细胞在37°C下用0.1 U/mL的霍乱弧菌神经氨酸酶预处理1小时后，按照上述方法制备并注入流动腔室，流经活的IL-1β刺激的HBMEC-60细胞。
- 检测经蛋白酶消化的KG1a细胞在IL-1β刺激的HBMEC-60细胞上的滚动。将KG1a细胞在37°C下用0.2 U/mL的菠萝蛋白酶预处理1小时后，按照上述方法制备并注入流动腔室，流经活的IL-1β刺激的HBMEC-60细胞。
6. NIS-Elements 捕获的 KG1a 细胞分析及 KG1a 细胞滚动数据作图
- 获取时间序列后，保存数据。
- 转到菜单栏中的“measure”选项卡，选择“define threshold”。移动滑块，使目标细胞显示为红色。选择“all images”，然后点击“Okay”。此时整个延时序列应已更新，可见红色滚动细胞。
- 进入“Measure”，选择“restrictions”（限制条件可排除不代表滚动细胞的阈值化对象，主要为HBMEC-60单层细胞产生的背景信号）。选择“area”（面积），输入滚动细胞的最小和最大面积值；对“elongation”（长宽比）和“circularity”（圆形度）重复此步骤。
- 选择“measure”，然后选择“create binary using restrictions”，并设置限制参数，以优化NIS-Elements软件对HBMEC-60细胞单层上滚动细胞的识别效果。
- 返回“measure”，选择“Field data”，然后选择“reset data”，关闭该菜单。
- 回到“Measure”，选择“scan field”。
- 打开“Measure”中的“Field data”，选择“number or Objects”（对象数量），然后选择“all fields”，并将数据导出至Microsoft Excel。
- 选择“clear data”，以准备NIS-Elements细胞采集系统进行下一次数据采集。
结果：
图3. KG1a细胞上E-选择素结合活性的平行板流动腔分析。用神经氨酸酶或蛋白酶处理的KG1a细胞，在经IL-1β预处理的HBMEC-60细胞单层上进行滚动效率分析。阴性对照滚动实验通过分析KG1a细胞在未受IL-1β刺激的HBMEC-60细胞上，或在经中和性抗人E-选择素单克隆抗体（5D11）处理的IL-1β刺激HBMEC-60细胞上的滚动情况进行。细胞滚动频率实验均设三重复，使用NIS-Elements软件进行分析。（*具有统计学显著性；p<0.001）
在本视频报告中，我们以可视化方式展示了如何在生理剪切应力条件下分析白细胞与内皮细胞之间的相互作用。具体而言，我们分析了E-选择素及其配体在介导白细胞捕获与滚动过程中的作用，这种黏附行为是通过整合素和透明质酸受体等受体实现后续更稳定结合的前提。采用适配倒置显微镜的平行板流动小室系统，结合哈佛注射泵、摄像机及计算机/细胞采集硬件，我们开展了实验：以表达E-选择素配体的KG1a细胞作为白细胞模型，以经促炎性细胞因子IL-1β刺激的hBMEC细胞（HBMEC-60）作为表达E-选择素的人源内皮细胞模型（1-6）。如先前报道，我们观察到KG1a细胞在IL-1β刺激的HBMEC-60细胞上表现出显著的滚动行为，且该现象在多种剪切应力水平下均呈E-选择素依赖性（图3）（与在未受IL-1β刺激的HBMEC-60细胞上KG1a细胞的滚动相比，差异具有统计学意义）。同时设置了阴性对照组，包括KG1a细胞在未经IL-1β刺激的HBMEC-60细胞上的滚动，以及在经抗人E-选择素单克隆抗体预处理的IL-1β刺激HBMEC-60细胞上的滚动，以验证滚动活性对细胞因子刺激和E-选择素表达的依赖性（图3）。此外，对经霍乱弧菌神经氨酸酶（唾液酸酶）或菠萝蛋白酶（一种可降解细胞表面E-选择素糖蛋白配体的非特异性蛋白酶）预处理的KG1a细胞进行滚动分析，进一步凸显了末端唾液酸残基和细胞表面糖蛋白在E-选择素配体活性中的关键作用（2,3）。
讨论
平行板流动腔分析是一种专门的体外检测系统，用于在类似于后微静脉表面所受剪切应力的条件下，研究白细胞与内皮细胞之间的黏附相互作用。正如我们在本视觉展示中所示，我们证明了该系统在研究E-选择素与E-选择素配体在介导白细胞于活化微血管内皮表面发生捕获和滚动过程中的作用方面的价值。我们还展示了蛋白酶、糖苷酶以及阻断性抗体处理在阐明该系统中E-选择素及其配体功能方面的应用。这些分析具有高度可重复性，为在体内研究E-选择素与E-选择素配体功能提供了实验基础。
除了使用细胞因子活化的微血管内皮细胞（hBMEC 或人脐静脉或皮肤微血管内皮细胞）单层研究细胞黏附外，还可利用纯化的重组人 E-选择素或 E-选择素-Ig 嵌合分子作为细胞黏附的底物进行检测。也可通过平行板流动腔技术检测由白细胞（L-）选择素和血小板（P-）选择素介导的其他黏附相互作用。通过改变细胞单层/蛋白底物类型或输入的白细胞/选择素转染细胞模型，研究人员可在生理剪切应力条件下研究这些相互作用的功能。
披露
作者无利益冲突或披露事项。
致谢
本项目获得了美国癌症协会研究学者奖（06-024-01-CSM，授予 Charles J. Dimitroff）；美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助项目（RO1CA118124，授予 Charles J. Dimitroff）；以及美国国立卫生研究院/国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所资助项目（P30 AR042689，授予 Thomas S. Kupper 博士；马萨诸塞州波士顿市布莱根妇女医院）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178-500ML | |
| DPBS | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 14190 | |
| 0.5 M EDTA | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 15575-038 | |
| 1 M HEPES | GIBCO，Life Technologies 公司 | 15630 | |
| 平行板流动腔试剂盒 | GlycoTech | 31-001 | |
| PHD2000 可编程注射泵 | 哈佛仪器 | PHD 2000 | |
| 35x10毫米组织培养皿 | BD 生物科学 | 353001 | |
| 人血浆来源的纤连蛋白 | Sigma-Aldrich | 86088-83-7 F2006-2MG | |
| 白细胞介素-1_，人；重组 | Sigma-Aldrich | I9401-5UG | |
| HBSS（Hank氏平衡盐溶液） | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 14170 | |
| 含 HEPES 的 199 培养基 && 谷氨酰胺 | Invitrogen | 12320-039 | |
| 人血清 | Innovative Research, Inc. | IPLA-SER1 | |
| 肝素 | Abraxis BioScience | 504011 | |
| 重组人成纤维细胞生长因子 | R&D Systems | 233-FB | |
| 青霉素-链霉素 | GIBCO，Life Technologies 公司 | 15140 | |
| 塑料试管 | BD 生物科学 | 352008 | |
| 抗人E-选择素克隆BBIG-E4(5D11) | R&D Systems | BBA16 | |
| 菠萝蛋白酶 | Sigma-Aldrich | B-4882 |
参考文献
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- Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
- Dimitroff, C. J., Descheny, L., Trujillo, N., Kim, R., Nguyen, V., Huang, W., Pienta, K. J., Kutok, J. L., Rubin, M. A. Identification of leukocyte E-selectin ligands, P-selectin glycoprotein ligand-1 and E-selectin ligand-1, on human metastatic prostate tumor cells. Cancer Res. 65, 5750-5760 (2005).
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