下肢缺血小鼠模型

摘要

展示了诱导单侧后肢缺血的手术操作，并通过激光多普勒血流成像证实缺血效果。

摘要

在美国，外周动脉疾病（PAD）影响约1000万人，在全球范围内也十分普遍。目前用于缓解症状的药物治疗手段有限。外科手术或血管内介入治疗对部分患者有效，但长期效果往往不理想。因此，亟需开发新的PAD治疗方法。小鼠后肢缺血模型是研究PAD的一种有效模型，可用于测试新疗法。与其他组织缺血模型（如冠状动脉或脑动脉结扎）相比，股动脉结扎提供了一种更为简单的缺血组织模型。该模型的其他优势还包括易于暴露股动脉以及较低的死亡率。

在本视频中，我们展示了单侧后肢缺血小鼠模型的建立方法。将详细介绍创建和评估该模型所需的特定材料与操作步骤，包括利用激光多普勒成像技术评估肢体灌注情况。该方案还可用于细胞移植及无创追踪，黄 et al.¹ 已对此进行了示范。

方案

1. 单侧后肢缺血的诱导

1. 本手术所需的手术器械包括：精细尖头镊子、尖头镊子、弹簧剪、手术剪、持针器和牵开器。我们使用回形针自制牵开器，因其尺寸小于市售的牵开器。手术前需通过高压灭菌器或热珠灭菌器对这些器械进行灭菌。本手术还需要电凝器和无菌精细尖头棉签。建议在手术过程中根据需要对器械尖端进行重复灭菌。
2. 器械准备就绪后，将小鼠放入麻醉诱导舱中，以1 L/min的流速通入含1–3%异氟烷的100%氧气。
3. 将小鼠留在诱导舱内直至其对外界刺激无反应。随后将动物从诱导舱中取出。建议在打开舱盖前先用气体冲洗麻醉舱，以减少操作者接触异氟烷。
4. 然后将动物仰卧位放置于术前操作台，并连接持续气流的异氟烷麻醉系统。使用电动剃毛器去除后肢毛发，再涂抹脱毛膏以彻底清除残留毛发。
5. 将小鼠仰卧位置于手术台上覆盖有无菌布的加热垫上，并连接持续气流的异氟烷麻醉系统。用胶带伸展并固定后肢。固定后，使用碘伏和酒精交替擦拭皮肤三次进行消毒。在后续手术过程中，使用解剖显微镜在10倍或20倍放大下观察后肢区域，以获得清晰的放大视野。
6. 使用精细镊子和手术剪，从膝关节向内侧大腿方向做一长约1 cm的皮肤切口。
7. 使用磷酸盐缓冲液（PBS）湿润的精细尖头棉签，轻轻擦除股部肌肉周围皮下脂肪组织。
8. 接着，横向使用电凝器切开并分离皮下脂肪组织，以暴露其下方的股动脉。
9. 使用牵开器撑开切口，以便更清晰地观察下肢血管结构。
10. 使用精细镊子和精细尖头棉签，轻轻穿破膜性股鞘，暴露神经血管束。
11. 然后，使用一套洁净的精细镊子和棉签，在靠近腹股沟的近端位置将股动脉与股静脉及神经分离。分离后，在股动脉近端下方穿入一根7-0丝线缝线。使用双结结扎近端股动脉。结扎位置应尽可能靠近切口近端，以便为第二次结扎及中间待切断的血管段保留足够长度。
12. 在靠近膝关节的远端位置，将股动脉与股静脉分离。在股动脉远端、腘动脉近端下方穿入一根7-0缝线，使用双结结扎该血管。
13. 在第一道结扎线近端稍远处，用第二道双结结扎远端股动脉。这第二道缝线将在切断血管时用于夹持动脉。
14. 同样，为便于夹持，在第一道结扎线远端稍近处，用第二道双结结扎近端股动脉。
15. 使用精细尖头棉签和一对弹簧剪，在远端与近端结扎线之间的股动脉段进行切断。操作时需小心，避免刺破股静脉壁。
16. 移除牵开器，使用5-0 Vicryl缝线关闭切口。此类缝线无需后期拆除，因其可自行吸收。
17. 切口关闭后，将动物置于恢复笼内覆盖有无菌布的加热垫上，并持续监测直至清醒。
18. 动物恢复1小时后，进行激光多普勒血流灌注检测，以确认缺血模型的成功建立。

2. 激光多普勒血流灌注

1. 开始激光多普勒灌注步骤时，将小鼠放入麻醉诱导室中，使用1–3%异氟烷（溶于100%氧气），气体流速为1 L/min。
2. 将小鼠留在诱导室内直至其对外界刺激无反应。随后将动物从诱导室中取出。建议在打开盖子前先用气体冲洗麻醉箱，以减少操作者接触异氟烷。
3. 将动物置于连接持续异氟烷气流的术前操作台上。使用电动剃毛器去除后肢毛发，必要时再使用脱毛膏进一步处理。
4. 脱毛完成后，将动物置于37°C加热板上，在持续异氟烷麻醉下维持5分钟。监测核心体温以确保体温正常，因为温度变化会显著影响灌注水平。
5. 5分钟后，将动物仰卧位放置于非反光、吸光表面（如绿色布料）上，并连接持续异氟烷气流，伸展后肢。
6. 接下来，打开激光多普勒成像仪及图像采集软件，并初始化软件。设定视野大小和分辨率。为便于后续分析，建议在不同动物之间保持一致的视野范围和像素密度。
7. 新建文件，点击“开始”以启动图像数据采集。通常成像仪可自动检测小鼠距离，但如提示，需手动输入动物与成像仪之间的距离。激光将标示出视野边界，随后开始采集数据。
8. 数据采集完成后，图像将显示一系列颜色，反映后肢血流灌注水平。可根据特定灌注范围设定颜色标尺，以便更准确地比较不同动物之间的数据。
9. 数据采集结束后，保存文件。
10. 随后将动物放回恢复笼中，并持续监测直至完全清醒。
11. 分析数据时，使用分析软件中的阈值调节功能去除背景噪声。通常0.2的阈值为合理选择。选择两个感兴趣区域（ROIs），分别覆盖每侧后肢区域。可采用多种解剖标志以标准化不同肢体和动物间的ROI。随后计算ROI内的平均灌注值及其变异性，即可方便地得出缺血肢体与对照肢体之间的灌注差异和灌注比值。
12. 该操作可重复进行，以追踪后肢灌注随时间的变化。在预定时间点，可处死动物以评估组织功能，并与灌注成像数据进行比较。

3. 代表性结果：

后肢血管系统的解剖结构如图1²所示。图2展示了股动脉切除术后后肢的代表性示意图。为确认后肢缺血的建立，激光多普勒灌注成像分析显示，与对照侧肢体相比，缺血侧肢体的血流显著减少，如图3所示。

图1. 后肢血管系统的解剖结构。星号标示了为诱导后肢缺血而进行结扎的位置。

图2. 示意图显示股动脉在近端和远端结扎并切除股动脉后下肢的解剖结构。

图3. 激光多普勒成像显示左后肢缺血诱导前后血流情况（箭头所示）。

讨论

在设计和实施后肢缺血模型时，需考虑一些可能的变异来源。首先，缺血程度可能因结扎位置与侧支血管位置的关系而有所不同。因此，为了保证模型的一致性，动物应接受相同水平的动脉结扎。缺血恢复过程中的另一个变异来源与动物年龄有关：年轻动物（6–8周龄）的恢复速度更快且更完全，而年老动物（8–10月龄）则较慢，这一差异可通过血流动力学指标（如激光多普勒灌注成像）或功能学指标（如跑步机测试）进行评估。在评估促血管生成因子的研究中，使用年老动物可能更为合适，因为治疗干预后组间差异更明显。相反，在评估抗血管生成因子的研究中，则可能更适合使用年轻动物，以最大化效应量³。

若操作正确，应极少出现出血、感染或死亡等并发症。若因意外损伤股静脉或其他血管导致出血，应使用无菌棉签或纱布对出血部位施加适度压力，直至出血停止。出现感染迹象的动物应使用抗感染药物进行治疗。出现明显坏疽的动物可能需要实施安乐死。这种并发症在老年动物以及某些品系（如 BALB/c 小鼠⁴）中更为常见。此外，后肢缺血模型可能引起轻度至中度疼痛。因此，应根据 IACUC 的建议，按需给予布托啡诺或卡洛芬等镇痛药物以缓解疼痛。

综上所述，我们展示了一种在小鼠后肢缺血模型中研究外周动脉疾病（PAD）的简单且可重复的方法。结合激光多普勒成像分析的后肢缺血模型是研究血管病理变化及评估潜在治疗手段的优良体系。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
手术器械	工具	Fine Science Tools
Constix 棉签	工具	Contec	SC-4
聚维酮碘（碘伏）	试剂	PDI
70% 酒精	试剂	Kendall
磷酸盐缓冲液	试剂	Invitrogen
7-0 丝线缝合线	工具	Genzyme
5-0 薇乔缝合线	工具	Ethicon Inc.
电动剃须刀	工具	GE Healthcare
电灼器	工具	Baxter International Inc.
激光多普勒及 PeriScan PIM 3 系统	设备	Perimed