本实验方案描述了经刺激后可主动分泌IL-17的小鼠TH17淋巴细胞的检测与分离方法。
本文内容
摘要
摘要
MACS 细胞因子分泌检测试剂技术可实现单细胞水平分泌型细胞因子的检测，并能够灵敏地分离出有活性的细胞因子分泌细胞。为标记分泌 IL-17 的细胞，首先制备小鼠脾细胞的单细胞悬液，并在 37°C 下用 PMA/离子霉素刺激，以诱导细胞因子分泌。随后将细胞置于冰上以终止分泌，并加入 IL-17 捕获试剂——一种双特异性抗体，可结合白细胞表面的 CD45 以及分泌后靠近细胞表面被捕捉的 IL-17。接着将温度升至 37°C 以重新启动分泌过程，使 IL-17 被捕获试剂截留。之后再次将细胞置于冰上以终止分泌。为检测被截留的 IL-17，细胞与生物素标记的第二抗体（特异性针对 IL-17）以及抗生物素-PE 抗体共同孵育。此时细胞可直接用于流式细胞术分析，或进一步使用与 PE 结合的 MicroBeads 进行标记，以实现分离与富集。
关键词：MACS 细胞因子分泌检测, IL-17, 单细胞分析, 分泌细胞分离, 流式细胞术, MicroBeads, PMA/离子霉素, CD45, 捕获试剂, 生物素, PE 标记抗体, 小鼠脾细胞
方案
准备试剂
- 配制含有0.5% BSA和2 mM EDTA的PBS缓冲液。由于气泡可能堵塞MACS分离柱，缓冲液在使用前需进行脱气处理，并在2–8°C下保存。
- 我们使用含5%小鼠血清的RPMI 1640培养基。培养基中不应含有BSA或FCS，因为这些成分会影响细胞刺激的特异性。
- Miltenyi-Biotec公司的小鼠IL-17分泌检测试剂盒——细胞富集与检测试剂盒。该试剂盒包含以下组分：IL-17捕获试剂（IL-17 Catch Reagent）、IL-17检测抗体（生物素标记，IL-17 Detection Antibody (Biotin)）、抗生物素-PE（Anti-Biotin-PE）以及抗PE微珠（Anti-PE MicroBeads）。
刺激脾细胞
- 本实验需设置阴性对照和阳性对照，例如未刺激的脾细胞以及T细胞的复染对照。所有操作均需采用无菌技术进行。
- 使用gentleMACS™解离仪制备小鼠脾细胞的单细胞悬液。细胞浓度应通过细胞计数预先确定。在室温下以200×g离心10分钟，收集细胞沉淀。
- 离心后，使用移液器吸除上清液。切勿倾倒离心管，以免丢失细胞沉淀。
- 将细胞重悬于培养基中，然后加入孔板。加入足够的培养基，使细胞浓度达到每毫升一千万个细胞，每平方厘米五百万个细胞。
- 为在重悬细胞中诱导免疫反应，向样品中加入离子霉素（1 μg/mL）和PMA（10 ng/mL），并通过轻柔吹打混匀溶液。随后对各孔进行相应标记。
- 将细胞在37 °C孵育3小时，期间不进行混匀，以启动刺激过程。刺激开始后3小时进行IL-17分析，请合理安排实验时间。
- 为终止分泌，将细胞置于冰上，使用预冷缓冲液通过轻柔吹打收集刺激后的细胞。随后将细胞从孔板转移至离心管，并再次洗涤。
- 为确保完全回收细胞，建议在显微镜下检查培养皿。若仍有细胞附着，可用预冷缓冲液冲洗培养皿以收集残留细胞。细胞悬液中的任何细胞团块均可使用预分离滤器去除。
用捕获试剂标记细胞
- 必须注意，该检测在 IL-17 分泌细胞比例低于 2% 时效果最佳。
- 若预计 IL-17 分泌细胞浓度高于 2%，请相应调整试剂体积。
- 该实验流程的一个潜在问题是捕获试剂的交叉污染，即在标记过程中，双特异性抗体可能结合非分泌性 T 细胞，并捕获邻近淋巴细胞分泌的 IL-17，从而导致假阳性结果。
- 为避免此问题，必须在标记前将细胞充分冷却，并使用预冷缓冲液以减缓 IL-17 的扩散，防止交叉污染。除保持细胞低温外，还必须将其维持在特定浓度。
- 开始标记程序时，使用一千万个细胞置于 15 ml 可封口试管中。若需使用更多细胞，可按比例相应增加所有试剂体积。当达到最佳细胞浓度后，加入 10 ml 预冷缓冲液洗涤细胞。
- 在 2–8 °C 的冷藏离心机中以 300×g 离心 10 分钟。
- 离心后，用移液器彻底吸除上清液。切勿倾倒上清液，以免造成细胞损失和体积不准确。重复洗涤步骤，即加入 10 ml 预冷缓冲液，离心并吸除上清液。
- 当获得所需纯度的细胞沉淀后，将细胞重悬于 80 μL 预冷培养基中。为进行标记，加入 20 μL 小鼠 IL-17 捕获试剂。
- 将细胞置于冰上孵育 5 分钟。
- 冰上孵育 5 分钟后，取出试管，将细胞稀释于 10 ml 37°C 预温培养基中。然后将试管固定在 MACSmix 旋转混合仪上，在 37°C 下持续旋转孵育 45 分钟。将温度升至 37°C 可重新启动细胞因子的分泌。
使用IL-17检测抗体（生物素标记）和抗生物素-PE对细胞进行标记
- 在37°C孵育45分钟后，立即将离心管置于冰上，以终止细胞因子的分泌。此后所有操作均需保持细胞处于冰上。使用预冷缓冲液可避免捕获试剂发生交叉污染。
- 用预冷缓冲液充满离心管，在2–8°C条件下以300×g离心10分钟。彻底吸除上清液，并重复洗涤一次。
- 将细胞沉淀重悬于80 μL预冷缓冲液中，并将离心管置于冰上。
- 为避免抗体的非特异性结合，建议加入10 μL FcR阻断试剂，在冰上孵育5分钟。随后加入20 μL与生物素偶联的小鼠IL-17检测抗体（生物素标记），在冰上孵育10分钟。
- 再次按照前述方法洗涤细胞：加入10 mL预冷缓冲液，在2–8°C条件下以300×g离心10分钟。
- 吸除上清液后，将细胞沉淀重悬于80 μL预冷缓冲液中。
- 加入20 μL二抗Anti-Biotin-PE。
- 混匀细胞与二抗溶液，再次在冰上孵育10分钟。
- 第二次孵育完成后，用10 mL预冷缓冲液洗涤细胞并进行离心。
- 最后将细胞沉淀重悬于500 μL预冷缓冲液中。
- 若需对细胞进行分离以用于后续分析，可使用Anti-PE-MicroBeads进行磁性标记，并通过MACS柱和MACS分离器手动或自动分离细胞。
- 至此，脾细胞标记过程已完成，可进行后续分析。
FACS 分析
- 在本项分析中，我们将通过流式细胞术比较经刺激与未刺激的脾细胞。
- 在进行流式细胞术分析之前，细胞使用0.5 μg/mL的碘化丙啶染色，以排除死细胞。将各样本的200,000个细胞上样至MACSQuant™分析仪，随后观察各样本中抗体相对反应性的散点图。在利用流式细胞术分析稀有细胞（如IL-17阳性细胞）时，有两个关键注意事项：
- 在前向散射光与侧向散射光图中对淋巴细胞设门
- 排除死细胞（经碘化丙啶染色）和B细胞（可能引起非特异性背景染色），以进一步提高检测灵敏度
- 我们使用CD4-APC抗体检测T细胞，使用CD45R/B220-PerCP抗体检测B细胞。通过观察样本的前向散射光和侧向散射光特性，对淋巴细胞群体设门。
- 进一步设置第二个门，以识别被染色的死细胞和被染色的B细胞（Y轴），这些细胞在T细胞分析中被排除。
- 在此示例中（本质上为我们的阴性对照），可见未刺激样本中分泌IL-17的CD4阳性T细胞极少，约为0.003%（图4）。而在刺激后的T细胞群体中，可观察到大量分泌IL-17的CD4阳性T细胞：磁珠分选（MACS Technology）前约为0.367%（图5A），分选后达到60.76%（图5B）。
讨论
TH17细胞在适应性免疫和炎症反应中发挥重要作用，是介导自身免疫性炎症的关键组分。
本视频记录了如何使用 Miltenyi 的小鼠 IL-17 分泌检测试剂盒——细胞富集与检测（PE）。进行此操作时，重要的是要对起始细胞样本中分泌 IL-17 的细胞频率有一个预估。在标记和细胞因子分泌阶段保持适当的细胞浓度，可防止悬浮液中其他细胞的交叉污染，并确保结果的可靠性。
披露
所有实验方案和数据表均可在 www.miltenyibiotec.com 获取。
警告
试剂中含有叠氮化钠。在酸性条件下，叠氮化钠会生成剧毒的叠氮酸。叠氮化物在丢弃前应以流动水稀释。建议采取这些预防措施，以避免管道中形成沉积物，从而产生爆炸性条件。
材料
重印与许可
