Summary
此过程描述了小鼠Th17细胞的白细胞，积极分泌刺激后，IL - 17的检测和隔离。
Abstract
互助委员会的细胞因子的分泌检测技术，允许在可行的细胞因子分泌细胞的单细胞水平和敏感隔离分泌的细胞因子的检测。为了标签IL - 17分泌细胞，小鼠脾单细胞悬液，准备和刺激，在37 ° C至PMA /离子霉素诱导细胞因子的分泌。要停止分泌细胞，然后放置在冰暴露的IL - 17的捕获试剂，结合细胞表面的白细胞和IL - 17的CD45的分泌和细胞表面附近捕获，因为它是一个双特异抗体。分泌，然后重新开始提高温度至37 ° C和IL - 17是由Catch试剂被困。分泌，然后又停了下来，放置在冰细胞。要检测出被困IL - 17，第二个IL - 17特异性抗体结合，以生物素和抗生物素- PE抗体细胞培养。细胞现在可以直接通过流式细胞仪分析或准备与反PE标记的微球随后标签隔离和浓缩。
Protocol
准备试剂
- 含BSA（0.5％），和2毫米EDTA PBS缓冲区。由于气泡可以阻止磁珠分离柱，缓冲区，并储存于2-8 ° C，使用前需要脱气。
- 我们用RPMI 1640培养基中含有5％的小鼠血清。培养液中不应该包含BSA或FCS，这些化合物会改变细胞刺激的特异性。
- 小鼠IL - 17分泌含量 - 细胞富集和从美天旎生物技术检测试剂盒。该套件包含以下几部分组成的IL - 17的捕捉试剂，IL - 17检测抗体（生物素），抗生物素- PE，和反PE微球。
刺激的脾细胞
- 此协议是执行中存在的消极和积极的控制，如未刺激的脾细胞和T细胞的染液，。该协议是使用无菌技术进行。
- 准备一个单细胞悬液，小鼠的脾细胞中分离使用gentleMACS™Dissociator。通过细胞计数，细胞浓度应预先确定。颗粒的细胞在室温下10分钟，在200 × g。
- 离心后，吸出上清液用吸管关闭沉淀。不要调迁管，以避免损失颗粒。
- 现在，重悬的细胞在培养液中，然后添加到良好。添加足够的介质浓度为每毫升1000万细胞和细胞每平方厘米500万。
- 为了刺激免疫反应在悬浮细胞，我们添加离子霉素（1微克/毫升）和PMA（10毫微克/毫升）样品和混合解决方案，通过向上和向下轻轻吹打。然后井相应的标记。
- 现在，我们将孵育3小时，我们的细胞，在37℃，没有搅拌，开始的刺激期。继续从刺激开始到IL - 17的分析，3小时，所以相应的计划。
- 要停止分泌，细胞被放置在冰和我们收集的刺激细胞轻轻吹打冷缓冲区向上和向下。细胞，然后转移从井管，洗第二次。
- 为了确保所有细胞都收集，它是一个好主意，在显微镜下检查你的菜。如果细胞仍然保持连接，您可以收集冲洗用冷水缓冲菜剩下的细胞。采用预分离过滤器，可去除细胞悬液中的任何细胞团块。
标签捕获试剂细胞
- 这是最重要的要注意，这个实验工程优化，如果低于2％的IL - 17分泌细胞都存在。
- 如果预计的IL - 17分泌细胞浓度大于2％，相应地调整卷。
- 此过程中的陷阱是一个潜在的交叉污染，渔获物试剂，它可以在标签发生时的双特异抗体非分泌性T细胞和陷阱从邻近的淋巴细胞分泌IL - 17的结合，从而产生误报。
- 为了规避这个问题，关键是凉爽下来之前，标签和冷缓冲区的工作细胞缓慢的IL - 17的扩散和避免这种情况的交叉污染。此外，以维持细胞的冷，他们必须保持在一个定义的浓度。
- 要开始标签的过程中，我们使用一百万个细胞，在15毫升的Closable管。如果要使用更高的手机号码，只需规模相应的所有卷。一旦已获得的最佳细胞浓度，加入10毫升冷缓冲洗细胞。
- 离心10分钟在冷冻离心机（2-8℃）在300 × G细胞。
- 离心后，完全用吸管吸出上清液。不要倒出上清液，因为这会导致细胞的损失和不准确的卷。重复的洗涤步骤，包括加入冷的缓冲液，离心和愿望10毫升。
- 现在，我们有一个所需纯度的颗粒，在80μL冷培养基重悬细胞。给它们加上标签，现在我们将添加20μL小鼠IL - 17捕获试剂。
- 在冰上5分钟的孵育细胞。
- 在冰上5分钟的潜伏期后，取出管和稀释在10毫升37℃的温暖中期的细胞。然后安全MACSmix管肩管和管在37 ° 45分钟下连续运动的彗星。提高温度至37 ° C将重新启动细胞因子的分泌。
与IL - 17的检测抗体（生物素）和抗生物素PE标记的细胞
- 经过45分钟的分泌期在37 ° C，立即在冰上放置管。这将阻止细胞因子的分泌。从这里就可以保持细胞在冰上的关键。与寒冷的缓冲区工作将避免交叉污染渔获物试剂。
- 填充管冷缓冲区和离心机在300xg在2-8 ° C为10分钟。完全吸出上清液。重复清洗步骤有更多的时间。
- 细胞沉淀悬浮于80μL冷缓冲管置于冰上。
- 为了避免非特异性结合的抗体，我们建议除了加入10μlFCR阻断剂和5分钟的冰孵化。然后，我们添加20μL小鼠IL - 17检测抗体（生物素），结合生物素和10分钟在冰上孵育。
- 再次，洗在300xg加入10毫升冷缓冲区和离心机在2-8 ° 10分钟之前我们已经做了的细胞。
- 现在，吸出上清液，并在80冷缓冲液重悬细胞沉淀。
- 加入我们的二级抗体，抗生物素- PE 20μL。
- 细胞和二次抗体溶液混合，并再次孵育10分钟就冰管。
- 一旦这第二个孵化完成后，用10毫升冷缓冲区和离心机的细胞。
- 现在可以沉淀悬浮于500μL冷缓冲区。
- 如果要作进一步的下游分析分离细胞，它们可以被磁标记与反PE的微珠和失散的手动或自动使用Mac列和MACS分离。
- 现在，我们已经完成了脾的标签，并准备好进行分析。
流式细胞仪分析
- 对于我们的分析，我们会比较刺激和未刺激的脾细胞，用流式细胞仪。
- 之前，流式细胞仪分析，细胞染色为0.5微克/毫升与碘化丙啶门出死细胞。 MACSQuant™分析器装载每个样品20细胞，现在我们要看看样品中的相对抗体反应的散点图。稀有细胞分析的两个重要的考虑因素 - 如IL - 17阳性细胞 - 流式细胞仪检测：
- 淋巴细胞上设置一个门，前向散射与侧散点图
- 出死细胞（碘化丙啶染色）和B细胞（这可能会导致非特异性背景染色）浇注，进一步提高检测的灵敏度
- 我们用CD4 - APC抗体检测T细胞和CD45R/B220-PerCP抗体检测的B细胞。我们看到了样品的前部和侧散射性质和应用对淋巴细胞人口的门。
- 第二个门被应用到染色的死细胞和彩色B细胞（Y轴）。这些细胞是T细胞的分析排除。
- 在这个例子中，基本上是我们的阴性对照，我们可以看到，有很少IL - 17分泌的CD4阳性T细胞在未刺激样本 - 约0.003％（图4）。在刺激T细胞的人口来看，我们可以看到大量的CD4阳性T细胞分泌IL - 17 - 约0.367％（图5A）前分离磁选后MACS科技（图5B）和60.76％。
Discussion
Th17细胞在适应性免疫和炎症反应中发挥不可或缺的作用，并在推动自身免疫性炎症的重要组成部分。
此视频文件，如何使用美天旎的鼠标IL - 17的分泌含量 - 细胞富集和检测试剂盒（PE）。执行此过程时，重要的是要在您的起始细胞制备的IL - 17分泌细胞的频率估计。在适当的细胞浓度的标签和细胞因子的分泌期防止其他细胞的交叉污染，在您的暂停，并确保可靠的结果。
Disclosures
所有的协议和数据表www.miltenyibiotec.com。
警告
试剂含有叠氮化钠。在酸性条件下的叠氮化钠产量hydrazoic酸，这是毒性极强。叠氮化合物，应与运行前丢弃的水稀释。这些预防措施建议，以避免在管道爆炸国情的发展可能的存款。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse IL-17 Secretion Assay Cell Enrichment and Detection Kit (PE) | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-094-213 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx |
| RPMI 1640 | Medium | Miltenyi Biotec | 130-091-440 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx |
| CD4-APC | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-091-611 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx |
| CD8a-FITC | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-091-605 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx |
| Propidium Iodide Solution | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx |
| FcR Blocking reagent, mouse | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx |
| Dead Cell Removal Kit | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACSmix Tube Rotator | Instrument | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx |
| gentleMACS™ Dissociator | Instrument | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx |
| autoMACS Pro Starting Kit | Instrument | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx |
| MACS Columns | Tool | Miltenyi Biotec | http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx | |
| MACS Separator | Tool | Miltenyi Biotec |
