本文介绍了如何在嗅觉磁力固定装置（OMT）中固定果蝇。我们描述了如何对齐稀土磁铁和气味通道，以及如何设定刺激递送和真空抽吸的气体质量流速，以实现最佳的气味追踪效果。
本文内容
摘要
摘要
多年来人们已经明确，昆虫利用视觉线索在气流中稳定其飞行方向。许多动物会追踪由风携带的气味。因此，逆风追踪过程中的视觉稳定直接有助于气味追踪。但嗅觉信号是否能够独立于风力线索，直接影响视觉追踪行为？此外，近年来关于果蝇（Drosophila）嗅觉神经生理学与神经行为遗传学的研究激增，推动了技术上更为精密且定量化的行为检测方法的发展。在此，我们对原本用于视觉实验的磁悬浮系统进行了改进，在实验装置中引入了狭窄的层流气味流。将果蝇粘附于一根细钢针上，并将其悬浮于磁场中，使其能够自由偏航转动。将小直径的食物气味流自上而下引导至果蝇头部，可引发饥饿果蝇产生稳定的追踪行为。本文重点介绍固定装置的关键机械结构、磁体的对准、气味流的构建，以及稳定气味追踪行为的验证方法。
方案
引言
OMT 是一种磁力牵引系统的改进版本[1]，旨在整合“虚拟气味羽流模拟器”。以下方案将详细说明如何正确牵引果蝇（第1部分），以及设置磁体（第2部分）和质量流量调控的气味递送系统（第3部分）的策略。本文所述信息针对该特定系统进行了优化，若使用其他技术参数的组件，操作细节可能有所差异。
第1部分：固定果蝇
此处所述的固定步骤与许多先前的研究类似[2]，但已针对光镊显微镜（OMT）[3]的应用进行了调整。正确的固定对于确保实验的稳定性和可重复性至关重要。仔细进行固定的重要性再怎么强调也不为过。
- 收集羽化后4-6天的果蝇，并使其饥饿4-6小时。在无食物的试管中放入一张用水润湿的Kimwipe，以防止果蝇脱水。
- 将一批果蝇从培养瓶转移至小试管中，插入设定在约4摄氏度的帕尔帖冷却装置的黄铜块内。适当温度可在约30秒内使果蝇麻醉。
- 在冷却装置的冷表面上对果蝇进行分选。使用湿润的Kimwipe可确保持续冷却并从体壁吸收水分。选择体型最大的雌性果蝇用于固定。
- 使用细毛刷将单只果蝇推入特制的棺形装置中，该装置专为容纳一只野生型雌性果蝇而设计。
图1。
请点击此处查看该图的放大版本。 - 我们将一根微细针（Fines Science Tools）固定在显微操作器上的磁性杆上。针的位置应调整至其钝端接触果蝇头部后方、两翅之间的背部胸节。从正前方观察眼睛时，针应完全垂直。果蝇与针之间即使存在轻微的“翻滚”倾斜也不可接受。从侧面观察时，针与果蝇身体长轴之间的角度应相对于水平线呈30度的抬头角（图1）。注意：为了在磁悬浮系统中实现最佳操作，可能需要将针剪短至更合适的长度，具体取决于悬挂磁铁之间的距离。
- 当微细针对准后，使用一根细钢丝在微细针的钝端施加少量紫外光激活胶水（ElectroLite Corp）。
- 移动针头，使胶滴接触果蝇头部上方的胸部。若胶滴大小合适，胶水应从针头退火并流至胸部表面。注意不要使用过多胶水。
- 用两次各20秒的紫外光照射固化胶水。
- 将固定好的果蝇暂时放置一旁，重复上述步骤。将Kimwipe切成小方块，用镊子为每只固定的果蝇放置一块，以限制其飞行。
- 经过一小时恢复后，固定的果蝇即可用于实验。
- 不恰当的粘接可能会影响果蝇在磁悬浮装置中的表现。每次实验开始时，均应检查每只果蝇是否能够平稳旋转，以确保粘接正确。可通过旋转具有足够大空间周期的条纹图案来诱发强烈的视动反应[4]进行检测。如果果蝇的粘接角度俯仰不当，或相对于翻滚轴存在倾斜，则可能出现以下情况：(i) 果蝇完全无法旋转；(ii) 运动范围受限；或 (iii) 旋转速度不稳定。出现上述情况时，应弃用该果蝇并更换新的个体。若更换果蝇后问题解决，则极可能是由于粘接不当所致。（如果更换果蝇后问题仍然存在，请参见第2.4部分）
第二部分：磁体的对齐
正确排列磁铁（Rare-earth-magnets.com）对于果蝇实现平滑的360度运动范围至关重要。请按照以下步骤正确排列磁铁。
- 下部环形磁铁由塑料套管水平固定，并直接放置在一个透明的真空室顶部（图1；详见第3部分）。上部杆状磁铁垂直固定，位于下部磁铁上方约3/4英寸处。
- 通过将上部杆状磁铁置于下部环形磁铁中心点正上方，目视粗略对齐上下磁铁。建议将上部磁铁连接至微操作器（Siskiyou Inc.），以便进行精细调节。
- 在上部磁铁底面用环氧树脂粘接一个V型宝石轴承（Small Parts），以最小化旋转摩擦并标准化果蝇的定位。
- 将一只果蝇放入实验区域，调整上部磁铁的水平和垂直位置，直至果蝇能够在偏航轴上平稳、连续地旋转360度。每次实验开始时，应对每只果蝇检查其旋转是否顺畅，以确保磁铁正确对齐且个体使用的微小固定针无损伤（见第1.11部分）。若磁铁未正确对齐，果蝇可能出现以下情况：(i) 完全无法旋转；(ii) 运动范围受限；(iii) 旋转速度不一致。如果更换果蝇后问题消失，则很可能源于粘接不当（见第1部分）。如果所有果蝇均出现上述问题，则可能是磁铁对齐问题，需进一步调整。
- 警告：尽管操作稀土磁铁可能很有趣，但它们非常危险。不当使用可能导致设备损坏和/或轻微人身伤害。请务必极度谨慎对待这些看似无害却极易被低估的磁铁。
第3部分：气味递送
- 气味递送系统基于先前描述的一种系统 [5]，是优化过程中最具挑战性的部分（图 1）。该过程需要极大的耐心并反复进行试错。请按照以下步骤实现稳定的气味追踪。
- 气味系统的初始设置需要将细径特氟龙管（Small Parts）从气体多路复用器（Sable Systems International）连接至自行设计的水/气味小瓶。这些小瓶的出口通过相同的特氟龙管直接连接至皮下注射端口管。
- 在实验区域下方放置一个透明亚克力真空室以支撑磁铁。我们在果蝇下方安装一根 4 mm 玻璃管，并将其连接至真空室，使真空开口更接近果蝇，并减小开口直径。
- 使用镊子将一只固定果蝇放入实验区域内。
- 开启一种吸引性气味（苹果醋效果良好），并通过肉眼观察确认果蝇是否追踪该气味。如果果蝇对该气味似乎无偏好，则执行接下来的三个步骤。此过程可能需要使用多只果蝇并进行多次试验。
- 调整气味端口的位置，直至果蝇表现出对气味的追踪行为。我们将气味端口安装在微操纵器（Siskiyou Inc.）上，并将其定位在果蝇头部背侧 4 mm、前侧 3 mm 处。
- 调整质量流速，直至果蝇表现出对气味的追踪行为。我们的设定值为 7 ml/min（Sable Systems International MFC-4）。
- 调整真空流速，直至果蝇表现出对气味的追踪行为。我们使用流量调节器（Cole Parmer）将真空流速设定为 13 l/min。注意：构建的真空供气管线可能随时间发生波动，导致气味羽流结构不稳定。为保持恒定的真空流速条件，建议将外部真空泵连接至流量调节器。
- 当端口位置和流速设定完成后，使用气体多路复用器周期性地在水蒸气和气味蒸气之间切换，并通过肉眼观察确认果蝇仅在气味开启时进行追踪。有时，气味端口内部残留的气味可能在气味关闭时仍引发追踪行为。此问题可在不移除已准确定位的气味端口的情况下解决：将乙醇注入皮下注射管，并在递送端用 Kimwipe 纸巾收集；随后使用压缩空气吹出残留乙醇，即可继续实验。
代表性结果：
正确执行这些步骤后，应观察到两种现象。首先，在持续旋转的视觉刺激下，固定在OMT中的果蝇应沿偏航轴平稳地旋转360度。果蝇在无持续视觉刺激时表现出的“跳跃式”转向（称为扫视）是其自发转向行为的特征。如果果蝇明显无法平稳旋转，可能的原因包括粘附不当（见第1部分）或磁体未对准（见第2部分）。其次，当开启气味时，果蝇应朝向气味方向移动；当关闭气味时，果蝇应自发进行扫视，且在 arena 中无特定位置偏好。如果果蝇不能主动追踪气味羽流，则可能需要调整气味出口的位置、气流速率和/或真空流速（见第3部分）。
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讨论
将果蝇固定并在该实验装置中引发稳定的嗅觉追踪行为相对简单，但需要练习、耐心以及反复尝试。该装置的许多部分均可进一步优化或替换，从而拓展实验的潜在应用。例如，更新版本的真空室体积更小，可为装置下方留出更多空间。此外，还可略微调整稀土磁铁的强度和类型，并增加额外的气味通道，以提升实验中可使用的气味种类和（或）浓度数量。需要注意的是，任何设备上的改动均需进行针对性的优化。如本文所述，该嗅觉-运动追踪装置（OMTA）可使用户检测视觉线索对气味定位的影响。通过LED面板系统可呈现多种多样的视觉刺激，再结合气味递送系统的灵活性与可扩展性，该装置具备在多个层面上研究视觉-嗅觉整合的潜力。该系统还丰富了日益增多的果蝇定量行为检测方法，尤其适用于飞行成虫行为的表征研究。
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致谢
由美国国家科学基金会提供资助（M.F.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 冷却阶段 | Teca | LHP-300CP | |
| 黄铜冷却块 | 定制 | 约 4 x 8 x 2 cm | |
| 密封腔体（Sarcophagus） | 定制 | 详情请联系我们 | |
| 紫外激活胶 | Kemxert corp | KOA300 | 1 盎司瓶装可使用多年 |
| 面板系统 | Caltech | http://www.dickinson.caltech.edu/panels | [4] |
| 微型固定针（Minutien Pins） | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| 下部环形磁铁 | Rare-earth-magnets.com | NSN0615 | 5 - 0.75"外径 x 0.375"内径 x 0.125" |
| 上部杆状磁铁 | Rare-earth-magnets.com | NSN0750 | 0.125" x 1" |
| V型宝石轴承 | Small Parts, Inc. | VJ-0469-01 | |
| MFC-4 流量调节器 | Sable Systems International | ||
| 气体多路复用器 | Sable Systems International | ||
| 特氟龙管 | Small Parts, Inc. | STT-20-C | |
| 20 号皮下注射针管 | Small Parts, Inc. | HTX-20R-06 | |
| 玻璃管 | 4 mm 外径 | ||
| 真空流量调节器 | Cole-Parmer | EW-32464-52 |
参考文献
- Bender, J. A., Dickinson, M. Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila. J. Exp. Biol. 209, 3170-3182 (2006).
- Tammero, L. F., Dickinson, M. H. Collision-avoidance and landing responses are mediated by separate pathways in the fruit fly, Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 205, 2785-2798 (2002).
- Duistermars, B. J., Frye, M. A. Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight. Curr. Biol. 18, 270-275 (2008).
- Reiser, M. B., Dickinson, M. A modular display system for insect behavioral neuroscience. J. Neurosci. Methods. 167, 127-139 (2008).
- Frye, M. A., Dickinson, M. H. Motor output reflects the linear superposition of visual and olfactory inputs in Drosophila. J. Exp. Biol. 207, 123-131 (2004).
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