用于慢性体内记录的微型驱动阵列：四极电极组装

摘要

本方案中，我们演示了如何制备和处理用于微驱动阵列的四极电极，该微驱动阵列专为在大鼠中进行慢性电生理记录而设计。此外，我们还展示了微驱动阵列构建的最后阶段，包括安装接地导线和保护锥。

摘要

四电极阵列（tetrode）作为一种由四根电极组成的电极束，已被证实是体内同时记录多个神经元活动的有力工具。动作电位信号在四电极各通道间的振幅差异，使得研究者能够从多单元信号中分离出单个神经元的活动。精确控制四电极在脑内的立体定位坐标与植入深度，对于研究不同脑区之间神经活动的协调性至关重要。结合微型驱动阵列（micro-drive array），可在数天至数周的时间内实现多个四电极的精确定位与稳定调控。本实验方案将演示如何使用基本工具和材料制备并处理四电极，将其安装至用于大鼠慢性体内记录的多通道驱动四电极阵列中，完成微驱动阵列的接地导线连接，并在微驱动阵列上安装保护锥，以防止四电极与外界环境发生物理接触。

方案

1. 四极电极的制备

1. 通过取一根长50 cm、聚酰亚胺绝缘、直径为12.5微米的镍铬合金丝开始制作一个四极 Recording Wire。将该导线对折，用手指沿导线对滑动使其贴合在一起，确保整段长度上两根导线接触良好。
2. 再次将导线对折，使两端并拢。确保一端形成的环状部分无折痕。在无环的一端将四根导线剪断，使四个尖端对齐。
3. 下一步需要一个改装过的鳄鱼夹、一个电动旋转装置以及位于旋转装置上方的水平杆。改装鳄鱼夹的方法是在其基部粘接一根塑料杆。在导线尖端暴露的位置，用改装后的鳄鱼夹将四根导线夹紧。将导线环悬挂在水平杆上，然后将鳄鱼夹放入电动旋转装置中。
4. 在大约三分钟内，先顺时针施加80圈扭绞，再逆时针施加40圈扭绞。这些参数可根据实际需求进行调整。
5. 完成四极 Recording Wire 的扭绞后，使用热风枪（温度420°C或790°F，中低风速）从三个不同角度加热导线束，使其熔合。每个角度加热时，从导线束分叉点下方1-2 cm处开始，以距离导线约2 cm的位置上下移动热风枪，持续约5秒。注意高温会完全熔化绝缘层，导致短路。
6. 导线熔合后，轻轻提起鳄鱼夹以释放四极 Recording Wire 上的张力，从扭绞装置上取下四极 Recording Wire，并在靠近鳄鱼夹处将其剪断。在另一端剪开环状部分，得到四根长度相等且未粘连的导线单股。
7. 接下来，用尖端柔软的镊子轻轻弯曲导线，将顶部的各单股导线分开。
8. 此时四极 Recording Wire 已准备好装入微驱动阵列。再制作21至25根四极 Recording Wire，并将其存放在无尘盒中，直至进行四极 Recording Wire 装载步骤。

2. 将四极记录电极和接地线装入微驱动阵列

1. 开始之前，您需要准备一个完整的微型驱动阵列。如果您尚未制作，请参考视频《用于慢性体内记录的微型驱动阵列：驱动装置的制作》。在我们的设计中，四极记录电极（tetrode）一端连接至连接器硬件，另一端穿过微型驱动装置中的聚酰亚胺导管，使电极尖端延伸至微型驱动阵列底部以下。
2. 开始操作前，制作一个驱动装置固定架：一端可固定在连接板上，另一端可用Panavise夹具夹紧。本示例中，驱动装置固定架由一个Mill-Max连接器粘接在X-ACTO美工刀手柄的一端构成（图1c）。
3. 使用尖端柔软的镊子夹持四极记录电极，在体视显微镜下将电极尖端推入其中一个微型驱动装置的聚酰亚胺导管中。持续推进电极，直至各单根电极丝接近驱动阵列顶部的连接板位置。操作时需小心，避免电极丝发生弯折或扭曲，否则会导致电极以倾斜角度而非垂直方向进入脑组织，并削弱四极记录电极的结构完整性。
4. 使用尖端柔软的镊子，将四根导线的另一端分别小心地插入电极接口板上对应的孔中。同样需避免导线弯折或扭曲。待四根导线均就位后，使用下颚已截短的钳子将金针插入对应孔中。当金针插入孔内时，会自动剥离导线绝缘层并形成电学连接。
5. 为便于后续参考，请记录微型驱动装置与电极接口板上各引脚位置之间的对应关系。
6. 继续加载，共加载18根四极记录电极。阵列上剩余的三个微型驱动装置将用于安装参考电极。每个参考电极由一根四极记录电极构成，但仅使用其中一根未连接的导线末端。安装参考电极时，遵循相同的加载流程，但仅将四根电极丝中的一根连接至连接板上指定的参考电极引脚。
7. 若您计划进行多部位记录，建议提前规划四极记录电极与连接板之间的连接布局，以最大限度减少实验过程中误调电极的可能性。
8. 完成四极记录电极的加载后，制作两根接地导线：一根用于动物体，另一根用于保护罩。取一根6英寸长的绝缘钢丝（直径0.005英寸），使用金属镊子从该导线两端各去除3 mm的绝缘层；另取一根4英寸长的绝缘钢丝（直径0.005英寸），在一端去除3 mm绝缘层，在另一端去除1 cm绝缘层。
9. 将6英寸长的接地导线从微型驱动阵列侧面的孔中穿过，并向上引至接口板。使用金针将裸露的导线端连接至电极接口板上指定的接地孔。该导线将连接至动物颅骨。
10. 将4英寸长的接地导线与先前安装的接地导线平行布线。使用金针将去除3 mm绝缘层的一端连接至电极接口板上另一个指定的接地孔。该导线后续将连接至一个保护罩，该保护罩将充当小型法拉第笼，以减少噪声干扰。至此，导线连接工作已完成，接下来可进行四极记录电极的进一步优化处理。

3. 设置四极电极的长度

1. 本步骤的目标是将所有四极 Recording 电极（tetrodes）剪裁至略长于目标脑区深度的长度。以本例而言，微型驱动装置的设计最大行程为 5-6 mm，足以到达成年大鼠的多种新皮层区域及背侧海马。首先，将所有微型驱动装置下调，使四极 Recording 电极完全暴露。随后使用一把锋利的精细剪刀，一次性将所有四极 Recording 电极剪至比最终所需长度长约 5 mm 的位置。
2. 进行最终剪裁前，将一把带锯齿的剪刀固定于万能夹具（panavise）中。将其中一个手柄以略微向下倾斜的角度夹紧，并确保锯齿面朝上，另一个手柄则保持自由悬垂状态。
3. 现在通过向上旋转微型驱动装置，将所有四极 Recording 电极完全回撤至其引导套管（guide cannula）内部。
4. 在体视显微镜下，将其中一根四极 Recording 电极从其套管中完全伸出。使用刻度尺，将带锯齿的剪刀准确定位于距离引导套管所需长度的位置。缓慢而轻柔地以一次平稳动作剪断该 Recording 电极。剪断后，将微型驱动装置再向上回撤 3-4 mm。对每一根四极 Recording 电极重复此操作，直至全部完成剪裁。至此，即可进入金镀膜（gold plating）步骤。

4. 簇电极的镀金及质量检测

对镍铬四极导线进行镀金对于长期稳定的记录至关重要。它可以防止腐蚀并提高生物相容性。

1. 将阻抗仪设置为外部模式，电流发生器设置为直流检测模式并开启音频输出（图1d）。将电流发生器的两个探头依次接触每个四极记录电极内的六种可能的通道组合对，利用音频反馈判断是否存在短路。若发现短路，使用锯齿状剪刀重新剪切该四极记录电极，并再次测试。若问题仍然存在，则丢弃该四极记录电极并更换新的。
2. 当所有四极记录电极内部均无短路时，将所有微型驱动装置向下移动，使各四极记录电极尽可能完全伸出。
3. 调整设备配置以检测电极阻抗（图1e）。将所有四极记录电极的尖端浸入标准镀金溶液浴中。镀金液槽与阻抗仪的正极导线电气连接。通过将阻抗仪的负极导线接触连接板上对应的引脚来测量电极的阻抗。
4. 测量并记录微型驱动阵列上每一根导线的阻抗。正常值范围为1–3 MΩ。
5. 在电流发生器上，将电流设定在1–3 μA之间。随后，将阻抗仪的负极导线牢固地连接至连接板上的对应引脚。将设备配置为电镀模式（图1f）。在阻抗仪上快速从正常模式切换至旁路模式，再返回正常模式。在旁路模式期间，电流会流经四极记录电极和镀金溶液，使金沉积到电极尖端。每次电镀后的阻抗应低于之前。若阻抗未降至1 MΩ以下，需重复施加电流脉冲。可接受的保守阻抗范围为250 kΩ至350 kΩ。若阻抗低于200 kΩ，可能表明存在短路。
6. 若经过多次脉冲后阻抗仍未充分下降，则电极尖端可能被堵塞。重新剪切四极记录电极，检查是否存在短路，并重复镀金过程。若重新剪切无效，则更换四极记录电极并重新开始。
7. 完成所有四极记录电极的镀金后，将电极尖端短暂浸入乙醇中，然后静置干燥3至5分钟。
8. 使用电流发生器在四极记录电极尖端暴露于空气的条件下检测是否存在短路。若某一四极记录电极的两个或多个电极之间存在直流导通，则需重新剪切该电极，并再次进行镀金处理。
9. 在所有四极记录电极完成镀金后，在每个四极记录电极与其聚酰亚胺管之间的接口处滴加一滴中等粘度的氰基丙烯酸酯胶水。这将固定四极记录电极与微型驱动装置的连接，并保持电极长度不变。
10. 最后一步，通过将所有螺钉向上旋转，将全部四极记录电极收回至驱动装置内。

5. 安装保护锥

保护锥的作用是屏蔽微型驱动装置和暴露的四极导线免受环境影响。它还能在实验过程中提供操作支撑，并减少电噪声。我们使用3D打印的塑料锥体（参考第一部分：驱动装置的制作）。然而，也可以使用其他材料制作该锥体，例如弯曲的饮料罐碎片。

1. 取塑料锥体，并在其内表面或外表面固定一些铝箔胶带。
2. 接着，在锥体上钻一个直径为1.5 mm的小孔，并在锥体内部用垫圈和螺母松散地安装一颗螺丝，作为接地线的导电通路。我们建议使用0-80规格的螺丝与垫圈组合。
3. 首先，将三颗1-72规格（长度为3/16英寸）的螺丝插入锥体侧面并部分旋紧。将驱动阵列悬挂后，将锥体套在驱动器上。确保两根接地线均从驱动阵列底部引出。将4英尺长接地线裸露的一端在其中一颗1-72螺丝上缠绕数圈，然后将该螺丝拧紧。通过拧紧其余两颗锥体螺丝，将锥体牢固固定在驱动基座上。
4. 最后，取短接地线剥去1 cm绝缘层的一端，将其缠绕在铝箔胶带与垫圈之间的螺丝上，并通过拧紧螺丝固定接地线。此时，该微型驱动阵列已准备就绪，可用于外科植入手术。

6. 代表性结果

1. 微型驱动阵列的制作现已完成。您的微型驱动阵列已装载18根四极 Recording 电极和3个参考通道。该阵列被封装在保护性锥形外壳和顶盖中以增强耐用性。带保护锥的成品微型驱动阵列平均重量为20克至25克。
2. 成品驱动阵列通过标准外科手术程序进行植入。如您所见，驱动装置连接至一个前置放大器芯片以及一束导线，这些导线将信号传输至数据采集硬件和软件。

图1： A) 簇状电极（tetrode）扭转构型示意图。水平杆将未粘合的电极丝悬置于自动簇状电极扭转装置上方。 B) 用于测量簇状电极阻抗及电极镀金的装置。检测短路时电路连接方式不同：黑色导线连接至连接板上的另一个电极通道。 C) 自制微型驱动阵列固定工具的特写。圆柱形部件为X-Acto手术刀手柄，连接器为26针双排Mill-max连接器，两个部件通过牙科丙烯酸树脂粘合在一起。 D) 短路检测构型。通道X与通道Y为簇状电极四个通道中的任意两个不同通道。 E) 电极阻抗测量构型。电流源处于“关闭”状态，阻抗仪设置为“开启”和“测试”模式。 F) 电极尖端镀金构型。电流源设置为“开启”，音频“开启”，模式为“单极”，直流测试“开启”，电流设定为2微安（2 µA）。

讨论

本方案是分为两部分的系列方案中的第二部分：“用于慢性在体记录的微型驱动阵列”。微型驱动阵列与四极记录电极的结合，是在清醒且行为自由的动物模型中同步记录大量神经元活动的有力工具。希望我们已为您提供了在您自己的实验室中开展或改进电生理记录工作所需的全部必要信息。

电动四极丝扭转装置为定制设计和制作。我们提供了一家供应商及其产品编号，可供您订购功能类似的设备。或者，也可通过将电动旋转条形磁铁与连接鳄鱼夹的磁化搅拌棒组合，自行搭建电动旋转装置；但这种配置很可能需要手动计数旋转次数、手动反转旋转方向，以及手动启动和停止。

某些电极接口板没有用于连接电极导线的针孔式结构。相反，您可能获得的是带有从连接板伸出的金属引脚的接口板；这类金属引脚类似于标准电子元件上常见的引脚。我们简要概述一种将四极记录通道连接至金属引脚的方法。首先，去除每个四极记录电极四根导线末端的绝缘层。可通过手持丁烷喷灯，以火焰短暂灼烧每根电极的末端来实现去绝缘。准备一段能够轻松套在金属引脚上的热缩管，并确保加热后能紧密包裹引脚。将热缩管裁剪至与金属引脚等长。利用毛细作...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Panavise	工具	Panavise	型号 301	用于固定微驱动阵列或带锯齿的剪刀
改装的 Xcelite 378M 钳子	工具	Newark Inc	96F8903	用于插入连接器板引脚。制作方法：将钳子一端的尖端去除 2 mm。
慢固化胶水	材料	Great Planes (Champaign, IL)	GPMR6015	用于将四极电极粘接到微驱动装置上
镀金溶液	材料	Neuralynx Inc.	Sifco Selectron Gold NC	含有用于电镀的金颗粒
电流发生器	工具	World Precision Instruments, Inc.	A365D-B	又称刺激隔离器，用于将镀金溶液电镀到电极尖端
阻抗计	工具	BAK Electronics	IMP-1 / 6662 / 2788	用于检测电极的阻抗
热风枪	工具	Steinel (德国)	HG 3002 LCD	用于熔合电极以制成四极电极
Accu-Tek Carbofib 尖头镊子	工具	Aven	18768 (型号 304)	用于操作四极电极
鳄鱼夹	工具	Fine Science Tools	18050-35	又称 Bulldog serrefine，用于在绞合过程中夹紧四极电极
显微解剖剪刀	工具	Biomedical Research Instruments	25-1000	用于四极电极/电极导线的一般切割
Iris Toughcut 带锯齿剪刀	工具	Fine Science Tools	14058-09	用于四极电极的最终切割
聚四氟乙烯涂层不锈钢导线	材料	A-M Systems	790500	接地导线
12.5 微米镍铬导线	材料	Kanthal Palm Coast	Rediohm-800 1/4 HARD PAC COATING	聚酰亚胺涂层微导线，用于制作四极电极
四极电极绞合器	工具	Neuralynx Inc.	Tetrode Assembly Station	提高四极电极制作的速度和一致性
银漆	材料	GC International	22-023	用于将四极电极的微电极导线连接至连接器引脚（见讨论部分）
X-Acto 刀柄	材料	MSC Direct	X3001	用于构建微驱动装置的固定装置
26 针双排连接器	材料	Mill-Max	852-10-026-30-001000	用于构建微驱动装置的固定装置