本文介绍了用于测量果蝇幼虫神经肌肉接头处突触传递的电生理学方法。通过刺激运动神经元轴突可人工引发递质释放，而神经肌肉接头（NMJ）的传递情况可通过记录肌肉中诱发的突触后反应进行测量。
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本文内容
摘要
摘要
在本视频中，我们介绍在果蝇幼虫神经肌肉接头（NMJ）记录突触传递的电生理学方法。幼虫的神经肌肉系统是研究突触生理学和神经递质传递的经典突触模型，也是一种极具价值的研究工具，具有明确的遗传背景且易于进行实验操作。幼虫可经解剖以暴露体壁肌肉、中枢神经系统及外周神经。果蝇的肌肉及其神经支配模式已被充分表征，且肌肉易于进行细胞内记录。单个肌肉可通过其在8个体节中的位置和方向加以识别，每个体节包含30块肌肉，其排列模式在A2至A7节段中高度重复。解剖后的果蝇幼虫组织较薄，通过透射照明可清晰观察单个肌肉及成束的运动神经元轴突。1. 转基因构建体可用于标记特定细胞，以便进行视觉识别或在特定组织中调控基因产物。在幼虫中，当运动神经元在突触处释放谷氨酸囊泡时，会引发兴奋性接头电位（EJP）。在解剖后的幼虫中，可通过细胞内电极在肌肉中记录EJP。可通过轻柔负压将切断于腹神经节后方的运动神经元吸入玻璃移液管，并用微电极刺激，从而人工诱发动作电位。这些运动神经元在受到刺激时具有不同的放电阈值，当它们同时放电时，会在肌肉中产生反应。跨越神经肌肉接头（NMJ）突触传递的信号可在运动神经元所支配的肌肉中记录到。EJP和微型兴奋性接头电位（mEJP）表现为膜电位的变化。电生理反应在室温下的改良低离子血淋巴样溶液中记录。2(HL3) 缓冲液，其中含有 5 mM Mg2+和 1.5 mM Ca2+. 诱发EJP波幅的变化可以指示突触功能和结构的差异。对数字化记录的EJP波幅、mEJP频率和波幅以及量子含量进行分析。
方案
开始前准备：
- 游走期三龄黑腹果蝇幼虫
- HL3.1（改良型类似血淋巴）溶液
- 使用Brent和McCabe（2008）所述方法，在小型（35 × 10 mm）塑料培养皿中制备的Sylgard（透明硅橡胶）解剖板3。
- 将解剖针剪短
- 刺激电极移液管
- 尖锐记录移液管
HL3溶液：
- 在解剖和电生理实验过程中，幼虫需浸入 HL3.1 溶液2中，其成分（单位：mM）为：70 NaCl、5 KCl、4 MgCl2、10 NaHCO3、5 海藻糖、115 蔗糖和 5 HEPES，pH 值为 7.2。
- 通过向 HL3.1 溶液中添加 CaCl2 以达到所需的细胞外 Ca2+ 浓度。
- 幼虫解剖需在低 Ca2+ 浓度下进行（以避免肌肉收缩），使用含 0.25 mM CaCl2 的 HL3.1 溶液，并置于冰上保存。
- 电生理实验通常在含 1 mM CaCl2 的 HL3.1 溶液中进行，但可根据需要将 Ca2+ 浓度调整为 0.4 – 1 mM。
- HL3.1 溶液在使用前需经滤膜除菌，并于 4˚C 保存。
刺激和记录电极的制备：
- 使用Sutter P-2000激光拉制仪制备记录和刺激电极，拉制参数设置如下：加热强度 = 390，灯丝 = 4，拉速 = 35，延迟 = 200，拉力 = 0。
- 刺激电极由薄壁硼硅酸盐玻璃毛细管制成，其末端较宽，略大于切断的运动轴突的宽度。电极末端经火焰抛光（使用Narashige电极抛光仪）以获得光滑表面，从而最大限度减少对神经的损伤。刺激电极内充灌浴液（HL3.1 + 1 mM Ca2+）。
- 记录电极由1.2 mm硼硅酸盐玻璃管拉制而成，形成尖锐的电极尖端（电阻为30–60 mΩ），并充灌3M KCl溶液。
第1部分：黑腹果蝇幼虫的解剖
- 按照先前所述方法解剖三龄游走期幼虫，暴露体壁肌肉4。
- 解剖在含0.25 mM Ca2+的HL3.1溶液中进行，使用小型硅胶板（35 × 10 mm）。为麻醉幼虫，HL3.1溶液必须保持冰冻状态，并在解剖前及解剖过程中始终置于冰上。
- 幼虫解剖采用Brent和McCabe（2008）所述方法，并针对电生理实验进行了改良：在HL3.1解剖液中添加0.25 mM Ca2+，并使用较短的解剖针（长约2 mm），以降低实验过程中触碰显微镜物镜和电极的风险。
- 解剖完成后，切断幼虫的运动轴突。操作时轻轻夹住中枢神经系统（CNS）并略微提起，以便切断支配腹神经节后肌肉的周围神经，同时避免损伤肌肉（图1）。随后移除脑组织。
- 解剖后的幼虫样本用含1 mM Ca2+的HL3.1溶液清洗两次。
图 1. 示意图显示了解剖幼虫运动轴突的切割步骤。用镊子提起中枢神经系统，并在脑基部切断运动轴突。
第二部分：幼虫肌肉细胞的细胞内记录。
- 将解剖板放置在电生理显微镜上，用 HL3.1 + 1.5 mM Ca2+ 溶液浸没样本，并固定浴液电极使其与溶液接触。
- 所有实验均在第三腹节（A3）的肌肉6上进行。通过吸吮电极刺激支配肌肉的外周神经5。
- 首先将刺激电极置于培养皿中，以避免在细胞内电极就位后产生振动。将刺激电极放置在支配肌肉6的运动神经元附近，施加轻柔负压，直至切断的神经进入玻璃移液管内。施加负压时注意不要拉伸神经。将移液管略微抬高，使其不接触肌肉，并调整位置以避免牵拉切断的神经纤维（图2）。
图2. 果蝇幼虫一个腹节的肌肉及其支配运动神经元的示意图。图中展示了刺激移液管、切断的神经以及位于肌肉6上的记录电极的位置。 - 使用充满3 M KCl的尖锐微电极进行细胞内记录。将记录电极置于第三腹节（A3）肌肉6的中心上方，调节输入偏移量，使其在浴液中读数为零。在高光学放大倍数下缓慢降低电极，接近肌肉直至接触肌膜表面。观察示波器以确认是否已刺入肌肉。静息膜电位应至少为 -60 mV，否则不应使用该样本。此时应可见偶发的微型终板电位。记录开始前让细胞稳定1分钟。
- 膜电位变化通过Axon HS-2A前置放大器和Axoclamp 2B放大器检测，并使用Clampex v 8.2.0.235软件（Axon Instruments）进行记录。Axoclamp 2B通过Digidata 1322A接口与运行pCLAMP软件的计算机连接。
- 在无任何刺激条件下连续记录细胞3分钟，以测量mEJP反应。使用Mini analysis软件（Synaptosoft，v 6.0.3）分析轨迹信号，并确定mEJP的幅度和频率。
神经刺激：
- 使用一系列方波电压脉冲（持续时间 0.3 ms）刺激运动神经元的切断端，刺激强度应足以同时激活两条运动轴突，从而在整个肌肉中引发稳定的反应。
- 刺激信号由 Master-8 脉冲发生器产生，该发生器被编程为按照设定的持续时间和间隔时间连续输出脉冲。
- 每次刺激之间留出 5 秒间隔，以保证神经肌肉接头（NMJ）的突触功能恢复。
- 确定刺激强度时，应从最低水平开始，在多次试验中缓慢增加强度。实验中应采用能够引发反应的最小刺激强度。
- 当达到适当的刺激强度时，每次刺激应引发一个复合兴奋性接头电位（EJP）和一次肌肉收缩。
- 每块肌肉至少记录 10 次诱发电位，并对振幅取平均值。
第3部分：代表性结果
图 3. 来自肌肉 6 的代表性细胞内记录，显示在节段神经电刺激下诱发的兴奋性突触后电位（EJP）及其反应，以及偶发的微型终板电位（mEJP）。在健康野生型幼虫（如 Canton S）的肌肉 6 中，EJP 振幅通常约为 40 mV，mEJP 振幅则在 1–3 mV 之间。
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讨论
本文所述方法为检测神经肌肉接头（NMJ）突触功能变化提供了一种相对快速且广泛适用的手段。利用完整活体动物进行电生理记录，并实施遗传或药理学干预的能力，使果蝇成为研究神经传递生理学和遗传学特性的理想动物模型。
由于肌细胞体积较大，一些研究者可能倾向于在双电极电压钳（TEVC）记录方案中增加一个额外步骤。可在同一幼虫制备样本上，在细胞内电极已就位的情况下，通过在细胞上放置一个电流传递电极来完成该操作。当细胞达到充分的电压钳制后，即可记录其电流反应。
尽管肌肉6是最常用于电生理记录的肌肉，但肌肉7和肌肉12也可用于此类实验。
本文所述方法展示了果蝇神经肌肉接头（NMJ）电生理学的核心技术——这些技术最早由Jan和Jan于1976年描述，此后已成为研究突触生理学的模式系统。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 小型培养皿（35 × 10 mm） | BD 生物科学 | 1008 | |
| SYLGARD 182 硅胶弹性体试剂盒 | 道康宁 | 3097366-1004 | |
| 解剖显微镜 | 卡尔·蔡司股份有限公司 | 475002-9902 | |
| 显微镜光源 | 肖特公司 | KLI500 | |
| 解剖针 | 精细科学工具 | 26002-10 | |
| pClamp 9 软件 | 分子器件公司 | PCLAMP 9 STANDARD | |
| 解剖剪刀：3 mm Vannas 弹簧剪刀 | 精细科学工具 | 15000-0 | |
| Dumont SS 镊子 | 精细科学工具 | 11200-33 | |
| Dumont #5 镊子 | 精细科学工具 | 11252-20 | |
| 薄壁硼硅酸盐玻璃毛细管，带细丝（1.0 mm，4 英寸） | 世界精密仪器公司 | TW100F-4 | |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管，带细丝（1.2 mm，4 英寸） | 世界精密仪器公司 | 1B120F-4 | |
| Sutter P-2000 激光微管拉制仪 | Sutter 仪器公司 | Model P-2000 | |
| 移液管抛光仪 | 成茂国际 | MF-83 | |
| Axon HS-2A 头部放大器 | 分子器件公司 | Model HS-2A | |
| 显微操作器 | Sutter 仪器公司 | MP-85 | |
| Axoclamp 2B 放大器 | 分子器件公司 | AXOCLAMP 2B | |
| Clampex 软件 | 分子器件公司 | v 8.2.0.235 | |
| Mini analysis 软件，v 6.0.3 | Synaptosoft | ||
| Brownlee 精密放大器 | Brownlee | Model 410 | |
| NaCl | Baker/VWR | 4058-01 | |
| KCl | 西格玛-奥德里奇 | p-9333 | |
| NaHCO3 | 西格玛-奥德里奇 | s6297-1kg | |
| Trelahose | 西格玛-奥德里奇 | TO167 | |
| 蔗糖 | 费希尔科技 | bp220-212 | |
| HEPES | 西格玛-奥德里奇 | h-3375 | |
| MgCl-6H2O | 西格玛-奥德里奇 | m2670-1kg | |
| CaCl2 | 费希尔科技 | c79-500 | |
| Master-8 脉冲发生器 | A.M.P.I | ||
| 用于电生理实验设置的防震台 | 技术制造公司 | ||
| 法拉第笼 |
参考文献
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Protocol for dissection of Drosophila larvae. J Vis Exp. , (2008).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).
- Katz, L. C., Shatz, C. J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
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