果蝇幼虫神经肌肉接头突触电位记录的电生理学方法

摘要

本文介绍了用于测量果蝇幼虫神经肌肉接头处突触传递的电生理学方法。通过刺激运动神经元轴突可人工引发递质释放，而神经肌肉接头（NMJ）的传递情况可通过记录肌肉中诱发的突触后反应进行测量。

摘要

在本视频中，我们介绍在果蝇幼虫神经肌肉接头（NMJ）记录突触传递的电生理学方法。幼虫的神经肌肉系统是研究突触生理学和神经递质传递的经典突触模型，也是一种极具价值的研究工具，具有明确的遗传背景且易于进行实验操作。幼虫可经解剖以暴露体壁肌肉、中枢神经系统及外周神经。果蝇的肌肉及其神经支配模式已被充分表征，且肌肉易于进行细胞内记录。单个肌肉可通过其在8个体节中的位置和方向加以识别，每个体节包含30块肌肉，其排列模式在A2至A7节段中高度重复。解剖后的果蝇幼虫组织较薄，通过透射照明可清晰观察单个肌肉及成束的运动神经元轴突。¹. 转基因构建体可用于标记特定细胞，以便进行视觉识别或在特定组织中调控基因产物。在幼虫中，当运动神经元在突触处释放谷氨酸囊泡时，会引发兴奋性接头电位（EJP）。在解剖后的幼虫中，可通过细胞内电极在肌肉中记录EJP。可通过轻柔负压将切断于腹神经节后方的运动神经元吸入玻璃移液管，并用微电极刺激，从而人工诱发动作电位。这些运动神经元在受到刺激时具有不同的放电阈值，当它们同时放电时，会在肌肉中产生反应。跨越神经肌肉接头（NMJ）突触传递的信号可在运动神经元所支配的肌肉中记录到。EJP和微型兴奋性接头电位（mEJP）表现为膜电位的变化。电生理反应在室温下的改良低离子血淋巴样溶液中记录。²(HL3) 缓冲液，其中含有 5 mM Mg²⁺和 1.5 mM Ca²⁺. 诱发EJP波幅的变化可以指示突触功能和结构的差异。对数字化记录的EJP波幅、mEJP频率和波幅以及量子含量进行分析。

方案

开始前准备：

• 游走期三龄黑腹果蝇幼虫
• HL3.1（改良型类似血淋巴）溶液
• 使用Brent和McCabe（2008）所述方法，在小型（35 × 10 mm）塑料培养皿中制备的Sylgard（透明硅橡胶）解剖板³。
• 将解剖针剪短
• 刺激电极移液管
• 尖锐记录移液管

HL3溶液：

1. 在解剖和电生理实验过程中，幼虫需浸入 HL3.1 溶液²中，其成分（单位：mM）为：70 NaCl、5 KCl、4 MgCl₂、10 NaHCO₃、5 海藻糖、115 蔗糖和 5 HEPES，pH 值为 7.2。
2. 通过向 HL3.1 溶液中添加 CaCl₂ 以达到所需的细胞外 Ca²⁺ 浓度。
   • 幼虫解剖需在低 Ca²⁺ 浓度下进行（以避免肌肉收缩），使用含 0.25 mM CaCl₂ 的 HL3.1 溶液，并置于冰上保存。
   • 电生理实验通常在含 1 mM CaCl₂ 的 HL3.1 溶液中进行，但可根据需要将 Ca²⁺ 浓度调整为 0.4 – 1 mM。

讨论

本文所述方法为检测神经肌肉接头（NMJ）突触功能变化提供了一种相对快速且广泛适用的手段。利用完整活体动物进行电生理记录，并实施遗传或药理学干预的能力，使果蝇成为研究神经传递生理学和遗传学特性的理想动物模型。

由于肌细胞体积较大，一些研究者可能倾向于在双电极电压钳（TEVC）记录方案中增加一个额外步骤。可在同一幼虫制备样本上，在细胞内电极已就位的情况下，通过在细胞上放置一个电流传递电极来完成该操作。当细胞达到充分的电压钳制后，即可记录其电流反应。

尽管肌肉6是最常用于电生理记录的肌肉，但肌肉7和肌肉12也可用于此类实验。

本文所述方法展示了果蝇神经肌肉接头（NMJ）电生理学的核心技术——这些技术最早由Jan和Jan于1976年描述，此后已成为研究突触生理学的模式系统。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小型培养皿（35 × 10 mm）	BD 生物科学	1008
SYLGARD 182 硅胶弹性体试剂盒	道康宁	3097366-1004
解剖显微镜	卡尔·蔡司股份有限公司	475002-9902
显微镜光源	肖特公司	KLI500
解剖针	精细科学工具	26002-10
pClamp 9 软件	分子器件公司	PCLAMP 9 STANDARD
解剖剪刀：3 mm Vannas 弹簧剪刀	精细科学工具	15000-0
Dumont SS 镊子	精细科学工具	11200-33
Dumont #5 镊子	精细科学工具	11252-20
薄壁硼硅酸盐玻璃毛细管，带细丝（1.0 mm，4 英寸）	世界精密仪器公司	TW100F-4
硼硅酸盐玻璃毛细管，带细丝（1.2 mm，4 英寸）	世界精密仪器公司	1B120F-4
Sutter P-2000 激光微管拉制仪	Sutter 仪器公司	Model P-2000
移液管抛光仪	成茂国际	MF-83
Axon HS-2A 头部放大器	分子器件公司	Model HS-2A
显微操作器	Sutter 仪器公司	MP-85
Axoclamp 2B 放大器	分子器件公司	AXOCLAMP 2B
Clampex 软件	分子器件公司	v 8.2.0.235
Mini analysis 软件，v 6.0.3	Synaptosoft
Brownlee 精密放大器	Brownlee	Model 410
NaCl	Baker/VWR	4058-01
KCl	西格玛-奥德里奇	p-9333
NaHCO3	西格玛-奥德里奇	s6297-1kg
Trelahose	西格玛-奥德里奇	TO167
蔗糖	费希尔科技	bp220-212
HEPES	西格玛-奥德里奇	h-3375
MgCl-6H2O	西格玛-奥德里奇	m2670-1kg
CaCl2	费希尔科技	c79-500
Master-8 脉冲发生器	A.M.P.I
用于电生理实验设置的防震台	技术制造公司
法拉第笼