本文介绍了如何优化嗅觉磁束缚（OMT）装置所获取的视频图像。同时描述了两种用于研究视觉-嗅觉融合的示例性实验方案。
本文内容
摘要
摘要
飞行昆虫利用视觉线索在气流中稳定其航向。许多动物还会追踪随风飘散的气味。因此，逆风追踪过程中的视觉稳定直接有助于气味追踪。但嗅觉信号是否能够独立于风速线索，直接调控视觉追踪行为？此外，近年来嗅觉分子遗传学和神经生理学的进展推动了新型定量行为分析方法的发展，可用于评估特定嗅觉激活回路（例如通过遗传手段失活）对行为的影响。我们对原本用于视觉实验的磁悬浮系统进行了改进，在实验区域内引入了狭窄的层流气味流。本文重点介绍果蝇被固定后，在磁悬浮装置中进行自主导航时可开展的实验。我们展示了如何获取优化用于测量身体角度的视频图像，如何判断稳定的气味追踪行为，并举例说明两个用于研究视觉线索对气味追踪影响的实验。
方案
OMT 是一种磁力牵引系统的改进版本1，旨在整合虚拟气味羽流模拟器2。以下实验方案将说明如何优化所获取的视频图像（第1部分），以及如何开展两种基本的视觉-嗅觉联合实验（第2和第3部分）。
第一部分：视频采集
优化视频图像对于获取高质量的数据至关重要。请按照以下步骤操作以获得更清晰的图像。
- 使用镊子将一只新固定的果蝇放入实验区域。
- 将火线接口板载相机（Fire-I 1394store.com）置于透明亚克力真空室下方，使相机视野通过玻璃管垂直向上穿过腔室，对准固定果蝇的腹面。确保视频系统的镜头上没有红外滤光涂层。
- 为照亮果蝇，使用位于LED面板正下方的环形红外LED阵列（Small-Parts Inc），并将每个LED单独对准果蝇身体，以实现均匀照明。
- 为减少面板系统产生的反光，并最小化果蝇可感知的视觉线索，建议将相机视野内所有反光表面涂上哑光黑色涂料。同时应关闭室内灯光，以减少果蝇复眼可检测到的反光和亮度波动。
- 目视检查相机图像：果蝇应在黑色背景中呈现明亮的白色。若图像模糊，可能需要调节镜头焦距；若果蝇呈暗色，可能是LED阵列未对准或供电不足导致照明不充分；若背景中出现亮斑，可在果蝇正上方安装一片黑色绒纸圆盘，以减少背景反射。
- 我们使用基于Matlab编写的自定义子程序，结合图像采集工具箱（Image Acquisition toolbox）进行视频采集。
第2部分：果蝇寻找气味羽流
OMT 中的一个简单实验是观察一只饥饿（饥饿处理）的果蝇如何定位并主动追踪一股有吸引力的食物气味羽流。改变视觉环境会影响果蝇稳定追踪趋性食物气味的能力。需要注意的是，实验通常以随机区组设计进行，以尽量减少实验顺序带来的任何偏差。所有外部硬件（气体多路复用器、LED 实验 arena、视频采集系统）均由基于 Matlab（Mathworks）编写的自定义软件程序控制。
- 使用镊子将一只新固定的果蝇放入实验区域。
- 每次实验前，通过视觉显示系统使果蝇旋转数圈3，以确保其在完整的360度偏航轴上运动顺畅。如果果蝇旋转不顺畅，则应弃用。若问题持续存在，可能原因为磁铁未对准。注意：若在旋转测试中多个轨迹的 arena 航向分布出现显著峰值（即在360度范围内不平坦），则可能存在由磁铁未对准引起的取向偏差。
- 以随机顺序向果蝇呈现以下实验条件：i) 高对比度条纹图案，并从气味出口释放水蒸气；ii) 高对比度条纹图案，并释放吸引性气味蒸气；iii) 一条垂直条纹，其位置相对于水蒸气喷嘴偏移90度；iv) 一条偏移90度的单条纹，并伴有气味蒸气。根据我们的经验，在果蝇需自主寻找气味源的实验中，30秒的时间间隔效果良好。我们以30 Hz的频率在整个实验条件下采集视频，并使用Matlab编写的自定义软件程序进行离线图像分析（Matlab中最有用的内置函数之一是regionprops.m，该函数可分析椭圆的几何特性）。
- 当使用高浓度气味时，气味关闭后可能仍有残余气味从气味出口释放。为尽量减少其影响，可在关闭气味后，通过旋转全景图像使果蝇旋转数秒，以便系统清除任何残余气味。
- 在不同实验处理之间对果蝇进行视觉旋转也有益处，目的包括：(i) 保持果蝇对实验的积极参与；(ii) 防止果蝇长时间停留在同一位置。一个示例实验的顺序可能如下：i) 20秒初始诊断性旋转；ii) 5秒中间旋转；iii) 20秒条件组合#1；iv) 5秒中间旋转；v) 20秒条件组合#2。
第3部分：果蝇在气味羽流中的行为
OMT 中的另一个基础实验是将一只果蝇视觉上拖入气味羽流中，瞬时改变视觉条件，然后测量其保持在羽流中的能力。同样需要注意的是，所有实验均采用随机区组设计，以尽量减少实验顺序可能带来的偏差。
- 使用镊子将一只新固定的果蝇放入实验区域。
- 每次实验前，通过视觉观察使果蝇在实验区域内多次旋转（自转），以作为诊断性检查，确保该动物具备向各个方向定向的能力（参见 第 2.2 部分）。
- 在每种实验条件开始前，打开实验用气味源（水或醋），并通过在气味羽流位置处振荡一条小的垂直条纹，视觉上“拖拽”果蝇进入羽流中。该方法利用了果蝇中观察到的强烈条纹固定行为 [4]。
- 当果蝇已朝向羽流方向后，移除振荡的条纹，并呈现以下视觉刺激条件：i) 高对比度全景条纹伴随水蒸气（图 1A）；ii) 均匀背景伴随水蒸气（图 1B）；iii) 高对比度全景条纹伴随气味蒸气（图 1C）；iv) 均匀背景伴随气味蒸气（图 1D）。视频采集方法同 2.3。一个示例实验的流程顺序如下：i) 20 秒初始诊断性旋转；ii) 5 秒羽流位置条纹振荡；iii) 20 秒条件组合 #1；iv) 5 秒羽流位置条纹振荡；v) 20 秒条件组合 #2。
代表性结果：
图1
第1部分介绍如何优化OMT视频图像。视频图像应清晰显示在深黑色背景上的被照亮果蝇。对于过亮的图像，可通过降低背景干扰、减弱红外LED的强度或关闭室内灯光来改善。如果果蝇照明不充分，可通过调节红外LED的聚焦或调节其强度来解决问题。第2和第3部分描述了用于验证OMT正常运行的简单实验。在所有情况下，应通过视觉“强迫”果蝇（通过视觉运动反应）在实验 arena 中旋转数圈，以确保其具有平滑且完整的运动范围。在第2部分中，实验要求果蝇自主寻找气味羽流。为使果蝇持续参与实验、减少残留气味释放的影响，并防止果蝇在整个实验过程中保持单一航向，建议在每次试验之间短暂地进行视觉旋转。果蝇不应显著定位水蒸气羽流，而在存在丰富全景视觉线索的情况下，应始终能够定位气味羽流。在第3部分中，果蝇被直接视觉引导进入气味羽流，并被要求在多种静态视觉背景下维持其航向。如果果蝇被引导进入水蒸气羽流，它应迅速转向离开；如果果蝇被引导进入气味羽流且存在足够的视觉线索以支持稳健追踪，则果蝇将停留在羽流中。
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讨论
该系统的图像采集利用了一种廉价的火线接口板载相机以及使用Matlab编写的软件。清晰的图像对于获得准确的数据轨迹至关重要。上述策略有助于改善该系统中的图像质量。其他适用于该系统的视频追踪方法已有报道1。此外，该系统可轻松改造以实现实时视频追踪。本文所述的示例实验方案旨在为确保OMT系统的正常运行提供一个起点。研究者可尝试不同的视觉显示方式，甚至不同的气味刺激。
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致谢
由美国国家科学基金会向 MF 提供资助
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 火线摄像头 | 1394store.com | Fire-I 黑白板卡摄像头 | 4.3 mm 镜头，无红外涂层 |
| 红外发光二极管（IR LED） | Small Parts, Inc. | ||
| 黑色喷漆 | Rustoleum | 哑光黑 | |
| 黑色植绒纸 | Edmund Scientific | ||
| 面板系统 | Caltech | 3 | |
| Matlab 2006a | Mathworks | 图像采集工具箱 |
参考文献
- Bender, J. A., Dickinson, M. Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila. J Exp Biol. 209, 3170-3182 (2006).
- Duistermars, B. J., Frye, M. A. Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight. Curr Biol. 18, 270-275 (2008).
- Reiser, M. B., Dickinson, M. A modular display system for insect behavioral neuroscience. J Neurosci Methods. 167, 127-139 (2008).
- Götz, K. G. Course-control, metabolism and wing interference during ultralong tethered flight in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 128, 35-46 (1987).
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