仓鼠卵母细胞与小鼠胚胎的采集及冷冻保存

摘要

在本视频文章中，我们逐步演示如何采集并冷冻保存仓鼠卵母细胞，以获得较高的解冻后存活率。该方法同样可成功用于冷冻和解冻不同着床前发育阶段的小鼠胚胎。

摘要

胚胎和卵母细胞首次成功冷冻保存是在30多年前，当时Whittingham等 ¹和 Wilmut²分别描述了小鼠胚胎可在 -196 °C 下冷冻并储存，几年后，Parkening等.³报道了通过冷冻保存的卵母细胞进行体外受精（IVF）后成功诞生活产后代。自那时起，冷冻保存技术迅速普及，已成为人类和动物辅助生殖实践以及动物遗传资源保护中不可或缺的组成部分。目前，用于卵母细胞和胚胎冷冻保存的主要方法有两种：慢速冷冻和玻璃化冷冻。已有多种方法被尝试用于改进这两种技术，数百万只动物和数千名儿童已成功从冷冻保存的胚胎中诞生。然而，与冷冻保存相关的若干重要缺陷仍有待克服，因为冰晶形成、溶液效应和渗透性休克似乎会在解冻后的卵母细胞和胚胎中引发多种冷冻损伤。使用程序化冷冻仪进行慢速冷冻的优势在于可采用较低浓度的冷冻保护剂，而高浓度冷冻保护剂通常与化学毒性和渗透性休克相关；但在低浓度下，其抑制冰晶形成的能力有限。此外，慢速冷冻还会引发过冷效应，必须通过人工或自动诱导冰晶成核（seeding）加以避免。⁴. 在玻璃化冷冻过程中，高浓度的冷冻保护剂可抑制冰晶的形成，促使水分子转变为类似玻璃的非晶态固体状态，其中水虽已固化但未发生膨胀。然而，由于所用浓度下的冷冻保护剂具有毒性，卵母细胞/胚胎只能在最小体积的冷冻保护剂溶液中暴露极短时间，随后即需直接浸入液氮中。⁵. 在过去十年中，玻璃化冷冻法变得越来越受欢迎，因为它是一种非常快速的方法，且不需要昂贵的设备（如程序化冷冻仪）。然而，慢速冷冻仍然是卵母细胞/胚胎冷冻保存最广泛使用的方法。在本视频文章中，我们将逐步展示如何收集仓鼠卵母细胞并进行慢速冷冻，以获得较高的解冻后存活率。同样的操作流程也可成功应用于不同植入前发育阶段的小鼠胚胎的冷冻与解冻。

方案

动物护理和操作均按照西班牙巴塞罗那自治大学动物与人类研究伦理委员会批准的指南和规定进行。

一、卵母细胞采集

1. 检查并选择金黄地鼠（Mesocricetus auratus；8–12 周龄）雌性个体，观察其是否存在浓稠的阴道分泌物（排卵后分泌物）。
2. 对选中的雌性个体进行超数排卵诱导：先腹腔注射 40 IU 孕马血清促性腺激素（PMSG），60 小时后再注射 40 IU 人绒毛膜促性腺激素（hCG）。
3. 在注射 hCG 后 16 小时，将雌性地鼠置于二氧化碳安乐死舱中实施安乐死。
4. 如视频所示，从雌性个体中分离输卵管，并将其转移至一滴 KSOM-H 培养基中。
5. 在体视显微镜下，于 37°C 的透明质酸酶（156 U/ml）液滴中撕开输卵管壶腹部，以收集卵母细胞-卵丘复合体。卵母细胞将在约 5 分钟内从卵丘细胞中释放出来。
6. 从透明质酸酶溶液中拾取卵母细胞，并在 KSOM-H 培养基中清洗两次。

为收集小鼠胚胎，将雌性小鼠（Mus musculus；6-8 周龄）通过腹腔注射 5 IU 的 PMSG 以诱导超数排卵，48 小时后再注射 5 IU 的 hCG，并与雄性小鼠交配。根据 hCG 注射后的时间，在 24-26 小时、44-46 小时或 54-56 小时分别通过颈椎脱位法处死雌鼠，以获取原核期、2-细胞期或 4-细胞期胚胎。原核期胚胎的收集方法与仓鼠卵母细胞的收集方法完全相同。2-细胞期和 4-细胞期胚胎则通过用 KSOM-H 培养基冲洗输卵管获得[6]。
注意：按照本方案，每只雌鼠大约可收集到 20 至 30 个卵母细胞/胚胎。

二、冻存与解冻溶液的配制

1. 通过将 0.57 ml 丙二醇稀释于 5 ml KSOM-H 中，配制溶液 I（丙二醇终浓度为 1.5 M）。
2. 通过向含有 0.2052 g 蔗糖的离心管中加入 2 ml KSOM-H，配制解冻溶液（蔗糖终浓度为 0.3 M）。
3. 通过向含有 0.0684 g 蔗糖的离心管中加入 2 ml 溶液 I，配制冷冻溶液（丙二醇终浓度为 1.5 M，蔗糖终浓度为 0.1 M）。

注意：溶液 I 以及冻融溶液必须在使用前立即配制。但是，用于配制冻融溶液的蔗糖指定用量可预先称量，并在室温下储存于 3 ml 离心管中，可保存数月。

III. 冷冻方案

1. 将卵母细胞/胚胎从 KSOM-H 培养基转移至一滴溶液 I 中，并在室温下孵育 7–15 分钟。
2. 同时，准备一个 90 mm 的培养皿用于装载吸管：按照视频所示，每根吸管分别放置 90 µl 的冷冻液和解冻液（每种溶液各一滴/每根吸管）。
3. 将所需数量的卵母细胞/胚胎转移至冷冻液液滴中。
   注意：我们通常每滴中转移 5 至 30 个卵母细胞或胚胎。
4. 将一根吸管连接到口控吸引装置，并按以下顺序加载：溶液 I、空气、含卵母细胞的冷冻液滴、空气、解冻液滴、空气。
5. 吸管加载完毕后，继续抽吸，直至最先加入的液滴（溶液 I）上升至吸管顶端的聚合物处并封住该端。用热封法封闭吸管另一端，或使用塑料塞密封。
6. 打开程序化冷冻仪，选择冷冻程序。本方案所用的冷冻程序基于 Lassalle 等人 [7] 最初发表的降温速率：
   • 从室温以 2°C/min 降温至 -7°C
     0°C/min 维持 10 分钟，以实现温度平衡并诱导种冰（见下文）
   • 从 -7°C 以 0.3°C/min 降温至 -30°C
     0°C/min 维持 2 分钟，以实现温度平衡
   • 从 -30°C 以 35°C/min 快速降温至 -130°C
7. 将吸管插入程序化冷冻仪支架的槽中，确保吸管上含有解冻液液滴的一端朝外。启动冷冻程序。
8. 当样品温度降至 -7°C 且冷却暂停时，进行人工种冰操作：将镊子浸入液氮中，将支架稍向外拉出冷冻仪，使吸管上含有解冻液液滴的部分暴露出来，立即用镊子触碰该部位。对每个支架上的每根吸管重复此操作，然后继续运行冷冻程序直至结束。
9. 程序完成后，将支架迅速浸入液氮中。
10. 从支架上取下吸管，转移至已标记的冻存盒中。
11. 最后，将冻存盒存放在液氮罐中。

IV. 解冻方案

1. 从液氮罐中取出麦管。
2. 将麦管在室温下保持 40 秒。
3. 将麦管浸入 30°C 水浴中 40 秒。
4. 从麦管上取下封塞或剪开热封的尖端。
5. 将麦管内容物排入一个 35 mm 培养皿中，并轻轻混合含有冷冻液和解冻液的两滴液体。
6. 将卵母细胞/胚胎在混合液中于室温下静置 15 分钟。
7. 将卵母细胞/胚胎转移至一滴新鲜的 KSOM-H 液滴中，在 37°C 下继续孵育 15 分钟。
8. 卵母细胞/胚胎现已准备好进行后续操作。

注意：在步骤 6 和 7 中，由于重新水化，您应观察到解冻的卵母细胞/胚胎逐渐膨胀。

V. 代表性结果

采用本文报道的冷冻保存方案，仓鼠卵母细胞的存活率约为95%，而小鼠B6CBAF1胚胎在原核期、2细胞期和4细胞期的存活率分别达到>90%、85%和80%。小鼠胚胎解冻后若在KSOM培养基中进行体外培养，在最佳培养条件下，至少70%至80%应能发育至囊胚阶段。

建议在每次冷冻实验中包含一组对照组（麦管）的卵母细胞/胚胎，并在其余卵母细胞/胚胎用于后续操作之前先解冻该组。如果对照组的存活率低于预期，应从同一批次中再解冻一管。如果第二组的存活率仍然较低，则弃用该冷冻批次的其余麦管。

讨论

通过本方案，可成功冷冻保存仓鼠卵母细胞和小鼠胚胎。冷冻后，卵母细胞/胚胎可无限期地储存在液氮罐中，并可在任何所需的时间或地点随时复苏使用。这使得样本几乎随时可用，具有明显优势。另一方面，本方案也可用于建立珍贵小鼠品系（如转基因品系）的胚胎冷冻库，作为维持活体动物种群的一种经济且更安全的替代方法。需要注意的是，本方案已针对仓鼠卵母细胞和杂交B6CBAF1小鼠胚胎的冷冻保存进行了优化。已有文献报道，不同遗传背景的小鼠胚胎在解冻后的存活率存在差异^8,9，因此在建立卵母细胞或胚胎冷冻库前，应对每一种或每一品系的卵母细胞/胚胎评估其冷冻保存条件，并建立合适的方案。

仓鼠卵母细胞可用于人类辅助生殖诊所的精子穿透试验或精子染色体分析¹⁰，也可作为初学者练习胞浆内单精子注射（ICSI）的操作材料。另一方面，小鼠杂交B6CBAF1胚胎在原核期或2细胞期可用于人类辅助生殖中心或研究实验室，以检测胚胎培养液的质量或评估培养箱的功能是否正常。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料名称	类型	公司	目录编号	备注
法国型迷你细管 0.25 ml		Mini-tub	13407/0010
hCG		Farma-Lepori，西班牙	749036.4
透明质酸酶		Sigma	H-3884
KSOM-H 培养基				参考文献 [11]
液氮		Air Liquide
塑料塞		Mini-tub	19046
PMSG		Intervet，西班牙	1.614/8447
丙二醇		Fluka	82280
蔗糖		Merck	107687
手术剪		Aesculap	BC-060R；BG-061R
热封仪		SIZ	220
35 mm 和 90 mm 培养皿		Nunc	153066；150350
10 ml 离心管		Greiner Bio-one	163160
氮气罐		MVE, Cryogenics	XC 43/28
程序化冷冻仪		Planner Products Ltd.	Kryo-10 Series III
镊子		Aesculap	BD-331R；BD-053R；OC-020R