在本视频文章中，我们逐步演示如何采集并冷冻保存仓鼠卵母细胞，以获得较高的解冻后存活率。该方法同样可成功用于冷冻和解冻不同着床前发育阶段的小鼠胚胎。
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本文内容
摘要
摘要
胚胎和卵母细胞首次成功冷冻保存是在30多年前，当时Whittingham等 1和 Wilmut2分别描述了小鼠胚胎可在 -196 °C 下冷冻并储存，几年后，Parkening等.3报道了通过冷冻保存的卵母细胞进行体外受精（IVF）后成功诞生活产后代。自那时起，冷冻保存技术迅速普及，已成为人类和动物辅助生殖实践以及动物遗传资源保护中不可或缺的组成部分。目前，用于卵母细胞和胚胎冷冻保存的主要方法有两种：慢速冷冻和玻璃化冷冻。已有多种方法被尝试用于改进这两种技术，数百万只动物和数千名儿童已成功从冷冻保存的胚胎中诞生。然而，与冷冻保存相关的若干重要缺陷仍有待克服，因为冰晶形成、溶液效应和渗透性休克似乎会在解冻后的卵母细胞和胚胎中引发多种冷冻损伤。使用程序化冷冻仪进行慢速冷冻的优势在于可采用较低浓度的冷冻保护剂，而高浓度冷冻保护剂通常与化学毒性和渗透性休克相关；但在低浓度下，其抑制冰晶形成的能力有限。此外，慢速冷冻还会引发过冷效应，必须通过人工或自动诱导冰晶成核（seeding）加以避免。4. 在玻璃化冷冻过程中，高浓度的冷冻保护剂可抑制冰晶的形成，促使水分子转变为类似玻璃的非晶态固体状态，其中水虽已固化但未发生膨胀。然而，由于所用浓度下的冷冻保护剂具有毒性，卵母细胞/胚胎只能在最小体积的冷冻保护剂溶液中暴露极短时间，随后即需直接浸入液氮中。5. 在过去十年中，玻璃化冷冻法变得越来越受欢迎，因为它是一种非常快速的方法，且不需要昂贵的设备（如程序化冷冻仪）。然而，慢速冷冻仍然是卵母细胞/胚胎冷冻保存最广泛使用的方法。在本视频文章中，我们将逐步展示如何收集仓鼠卵母细胞并进行慢速冷冻，以获得较高的解冻后存活率。同样的操作流程也可成功应用于不同植入前发育阶段的小鼠胚胎的冷冻与解冻。
方案
动物护理和操作均按照西班牙巴塞罗那自治大学动物与人类研究伦理委员会批准的指南和规定进行。
一、卵母细胞采集
- 检查并选择金黄地鼠（Mesocricetus auratus；8–12 周龄）雌性个体，观察其是否存在浓稠的阴道分泌物（排卵后分泌物）。
- 对选中的雌性个体进行超数排卵诱导：先腹腔注射 40 IU 孕马血清促性腺激素（PMSG），60 小时后再注射 40 IU 人绒毛膜促性腺激素（hCG）。
- 在注射 hCG 后 16 小时，将雌性地鼠置于二氧化碳安乐死舱中实施安乐死。
- 如视频所示，从雌性个体中分离输卵管，并将其转移至一滴 KSOM-H 培养基中。
- 在体视显微镜下，于 37°C 的透明质酸酶（156 U/ml）液滴中撕开输卵管壶腹部，以收集卵母细胞-卵丘复合体。卵母细胞将在约 5 分钟内从卵丘细胞中释放出来。
- 从透明质酸酶溶液中拾取卵母细胞，并在 KSOM-H 培养基中清洗两次。
为收集小鼠胚胎，将雌性小鼠（Mus musculus；6-8 周龄）通过腹腔注射 5 IU 的 PMSG 以诱导超数排卵，48 小时后再注射 5 IU 的 hCG，并与雄性小鼠交配。根据 hCG 注射后的时间，在 24-26 小时、44-46 小时或 54-56 小时分别通过颈椎脱位法处死雌鼠，以获取原核期、2-....
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讨论
通过本方案，可成功冷冻保存仓鼠卵母细胞和小鼠胚胎。冷冻后，卵母细胞/胚胎可无限期地储存在液氮罐中，并可在任何所需的时间或地点随时复苏使用。这使得样本几乎随时可用，具有明显优势。另一方面，本方案也可用于建立珍贵小鼠品系（如转基因品系）的胚胎冷冻库，作为维持活体动物种群的一种经济且更安全的替代方法。需要注意的是，本方案已针对仓鼠卵母细胞和杂交B6CBAF1小鼠胚胎的冷冻保存进行了优化。已有文献报道，不同遗传背景的小鼠胚胎在解冻后的存活率存在差异8,9，因此在建立卵母细胞或胚胎冷冻库前，应对每一种或每一品系的卵母细胞/胚胎评估其冷冻保存条件，并建立合适的方案。
仓鼠卵母细胞可用于人类辅助生殖诊所的精子穿透试验或精子染色体分析10，也可作为初学者练习胞浆内单精子注射（ICSI）的操作材料。另一方面，小鼠杂交B6CBAF1胚胎在原核期或2细胞期可用于人类辅助生殖中心或研究实验室，以检测胚胎培养液的质量或评估培养箱的功能是否正常。
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致谢
本工作由西班牙教育与科学部（BIO 2006-11792）和加泰罗尼亚自治区政府（2005-SGR00437）资助。作者谨此感谢Marc Puigcerver和Jonatan Lucas在培养基制备过程中提供的技术协助。特此致谢动物饲养中心（Servei d’Estabulari）全体工作人员对动物饲养的支持，尤其感谢Juan Jose Martin和Javier Benito在本视频部分录制工作中所做出的额外贡献。N.C.B.为葡萄牙科学技术基金会的资助学者，S.G.为西班牙教育与科学部的资助学者。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 材料名称 | 类型 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 法国型迷你细管 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori，西班牙 | 749036.4 | ||
| 透明质酸酶 | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H 培养基 | 参考文献 [11] | |||
| 液氮 | Air Liquide | |||
| 塑料塞 | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet，西班牙 | 1.614/8447 | ||
| 丙二醇 | Fluka | 82280 | ||
| 蔗糖 | Merck | 107687 | ||
| 手术剪 | Aesculap | BC-060R；BG-061R | ||
| 热封仪 | SIZ | 220 | ||
| 35 mm 和 90 mm 培养皿 | Nunc | 153066；150350 | ||
| 10 ml 离心管 | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| 氮气罐 | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| 程序化冷冻仪 | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| 镊子 | Aesculap | BD-331R；BD-053R；OC-020R |
参考文献
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of develo....
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