本文介绍了一种用于斑马鱼胚胎的固定方法，适用于长期成像、双光子成像和组织损伤技术，以及延时共聚焦成像。
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本文内容
摘要
摘要
长期以来，斑马鱼被用于通过活体透明胚胎的延时成像来研究发育过程中的细胞和分子机制。本文描述了一种用于长期成像的斑马鱼胚胎装片方法，并演示了如何利用共聚焦显微镜自动采集延时图像。我们还介绍了一种利用安装在双光子显微镜上的飞秒激光聚焦能量，在斑马鱼中对周围感觉轴突的单个分支造成可控且精确损伤的方法。成功的双光子轴突切断实验所需参数必须针对每台显微镜进行优化。我们将分别在一台自行搭建的双光子显微镜和一台蔡司510共聚焦/双光子显微镜上演示双光子轴突切断操作，以提供两个示例。
利用在感觉神经元特异性启动子驱动下表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因品系，可对斑马鱼三叉感觉神经元进行可视化观察1。我们已对该斑马鱼三叉神经模型进行改进，以直接观察活体斑马鱼胚胎中感觉轴突的再生过程。实验中，将胚胎用三卡因麻醉后置于凝固的琼脂糖液滴中固定。固定后的胚胎被密封于充满苯硫脲（PTU）林格氏液的成像室中。我们发现，这些胚胎可在成像室内持续成像12至48小时。首先采集单张共聚焦图像，以确定轴切所需的靶位点。在双光子显微镜下以低功率（非损伤性）成像定位目标感觉轴突区域。在放大至预定轴切位点后，提高激光功率，对该特定区域进行单次扫描即可切断轴突。随后在共聚焦显微镜上设置多点时间序列成像，以直接观察轴突损伤后的恢复过程。
方案
第1部分：斑马鱼胚胎的长期成像固定
- 准备1%低熔点琼脂糖溶液用于包埋。将琼脂糖溶于去离子水中，微波加热溶解后分装至小管中，并置于42摄氏度的加热块中保存。
- 选择用于成像的胚胎，并用镊子轻轻撕开绒毛膜以去除。可在受精后22-24小时（hpf）将胚胎置于含5% PTU的林格氏液中，以抑制色素形成。这有助于提高成像清晰度，对于执行感觉轴突的双光子轴突切断实验至关重要。若允许自然色素形成，则在双光子显微镜下自体荧光会遮蔽轴突。斑马鱼用林格氏液含有116 mM NaCl、2.9 mM KCl、1.8 mM CaCl2 和 5 mM HEPES，pH 7.2。
- 通过向PTU林格氏液中加入约0.02%三卡因对胚胎进行麻醉。在继续操作前，需确认动物对触碰无反应。
- 通过在玻璃或聚四氟乙烯环的一侧涂抹真空脂，将其固定在盖玻片上，以制备长期成像用培养室。
- 用玻璃移液管将一个胚胎转移至42摄氏度的琼脂糖溶液中，注意避免带入过多PTU林格氏液，然后将胚胎连同一滴琼脂糖转移至已准备好的盖玻片上。
- 在琼脂糖凝固过程中将胚胎调整至所需位置。请注意，操作完成后需将成像室翻转，使盖玻片成为顶部表面。
- 若使用电动载物台并需同时对多个位置成像，请对每个胚胎重复步骤1.4–1.6。
- 待琼脂糖完全凝固后，向环内加入含0.02%三卡因的PTU林格氏液。
- 在环的另一侧涂抹真空脂，然后用载玻片覆盖环。将密封的成像室翻转。这些成像室可用于正置或倒置显微镜的成像。
第二部分：使用定制的双光子显微镜结合Chameleon钛宝石激光器进行双光子轴突切割
- 准备成像。将固定好的胚胎置于显微镜载物台上的载玻片夹中。使用40倍（0.8 NA）水镜聚焦于其中一个胚胎。打开激光器。我们已能够使用以下参数稳定地观察并损伤表达GFP的神经元。为在不造成损伤的功率下观察轴突，请将激光波长设为910纳米（nm），功率设为30毫瓦（mW；所列功率值为样品处的实际功率）。启动成像软件。我们使用Karel Svoboda实验室开发的ScanImage软件2, 3。
- 按下聚焦按钮，使用双光子激光扫描胚胎，定位需要进行轴突切断的轴突，并采集该轴突的图像。标记Z轴扫描的起始与终止位置，获取图像，并对Z轴图像序列生成最大强度投影图。
- 将目标轴突分支区域放大至70倍，并停止扫描。将样品处的激光功率提高至损伤性功率180 mW，然后用激光进行一次单次扫描。我们通过将Z轴切片数设为1并点击“Grab”来实现此操作。该操作应足以切断轴突。有关针对您的显微镜系统和实验目标优化该步骤的方法，请参见讨论部分。
- 缩小倍数，将激光功率调回30 mW，并采集图像。
第3部分：在蔡司510共聚焦/双光子显微镜上进行双光子轴突切割
- 将固定好的胚胎放置于载物台上，使用25倍水镜或其他合适的物镜将其调至焦点。
- 在多通道模式下开启双光子激光（910 nm）和氩离子激光（488 nm），以便可在两者之间切换。尽管两种激光均用于检测GFP，但双光子发射以红色显示，而氩离子激光发射以绿色显示，以区分二者。
- 使用氩离子激光识别待损伤的轴突。在Z轴设置中标记第一和最后一个光学切片。采集共聚焦图像，并对Z轴图像序列生成最大投影图。
- 选择待损伤的轴突区域，并将该区域调至焦点。关闭氩离子激光，开启双光子激光。以约9%透射强度的双光子激光扫描样本，确保轴突仍处于焦点位置。
- 点击“停止”按钮，以启用裁剪工具。使用裁剪功能放大至目标区域。通常放大至约70倍（可在“模式”选项卡下查看放大倍数）。在“通道”选项卡下，将双光子激光的强度从约9%透射调整至15–20%透射。
- 为切断轴突，按下“快速XY”按钮约1秒钟，然后按停止按钮以避免过度损伤。若操作成功，轴突应呈现为弥散的碎片状。
- 为确认轴突已受损，切换回488 nm氩离子激光，采集另一幅共聚焦图像，并生成最大投影图。
第4部分：在Zeiss LSM 510上进行共聚焦延时成像
- 准备成像。如果使用加热载物台，请务必提前至少30分钟开启。将固定好的胚胎置于显微镜载物台支架上。使用所需的空气物镜对其中一个胚胎进行调焦。我们使用的是20倍、0.5数值孔径（NA）的物镜。打开蔡司LSM 510成像软件，开启相应的激光器并设置所需的配置。接下来将详细介绍使用蔡司LSM Multi Time软件进行长期成像的详细方案。这些方法可根据您的显微镜和成像软件进行相应调整。
- 在Multi Time窗口中定义第一个胚胎的位置和配置。打开扫描、载物台和Multi Time窗口。在扫描窗口中启用快速扫描模式。移动载物台至所需的XY位置。在扫描窗口中标记第一个和最后一个Z位置。按下“Stop”，然后按下“Mid”（同样在扫描窗口中）。等待中间Z层面扫描完成后，点击载物台窗口中的“Mark Position”（标记位置）。如果仅对一个胚胎成像，请在Multi Time窗口中点击“Single Location”（单个位置）选项卡。点击“Replace XYZ”，然后点击“Save Configuration”（保存配置）。当提示是否覆盖先前配置时，选择确认。随后进入步骤4.4。如果使用的是电动载物台，可设置多个位置以对多个胚胎进行成像。此时应在定义第一个位置的XYZ和配置前，选择“Multiple Locations”（多个位置）选项卡。同时，请确保“Multiple Locations”选项卡下方的下拉菜单处于“Location 1”（位置1），且配置部分的下拉菜单显示为“multi loc 1”，然后再点击“Save Configuration”。
- 在Multi Time窗口中定义其余胚胎的位置和配置。定位下一个胚胎，按下快速扫描，将载物台移至所需的XY位置，并在扫描窗口中标记第一个和最后一个Z位置。按下“Stop”，然后按下“Mid”。等待中间Z层面扫描完成后，点击载物台窗口中的“Mark Position”。点击“Replace XYZ”。检查“Multiple Locations”选项卡下方的下拉菜单是否为“Location 2”，且配置部分的下拉菜单是否显示为“multi loc 2”，然后点击“Save Configuration”。当提示是否覆盖先前配置时，选择确认。对剩余胚胎重复此过程。
- 在Multi Loc窗口中设置图像采集参数。在“List of Blocks”（区块列表）部分选择“GR-G-L”选项，然后输入所需的组重复次数，即共聚焦显微镜在每个位置采集图像的次数。在“Parameters”（参数）部分输入所需的等待间隔时间，即一次成像重复开始到下一次成像重复开始之间的时间间隔。在配置部分选择“ZStackXY”。在底部区域输入基础文件名。点击“Select Image DB”并选择您的mdb文件。点击“Options”（选项）按钮，选择用于保存临时文件的mdb文件夹。勾选“keep final image open”（保持最终图像打开）、“save final image”（保存最终图像）和“middle of the z stack”（Z堆栈中间层面）。选择等待间隔时间。点击“OK”关闭选项窗口。点击“start time”（开始时间）。在整个成像过程中保持Multi Time窗口处于打开状态。
- 分析数据。当延时成像完成后，Multi Time软件会将所有临时文件汇总为每个位置的汇总文件。如果需要在成像完成前停止拍摄，请务必点击“Finish”（完成）而非“Stop”（停止），以确保生成汇总文件。临时文件和汇总文件应自动保存至指定的mdb文件夹。在LSM软件菜单中，点击“3D View”（三维视图），然后选择“Projection”（投影）。在下拉菜单中选择您的汇总文件后，点击“Apply”（应用），这将为每个共聚焦图像生成Z堆栈的最大强度投影。在LSM软件菜单中点击“File”（文件），然后选择“Export”（导出），将最大强度投影保存为一系列tif文件。随后可使用ImageJ或QuickTime Pro将这些tif文件序列合成为视频。可使用图像分析软件（例如MicroBrightfield公司的NeuroLucida）对LSM图像中的轴突进行三维追踪，以获得有关轴突形态的详细定量信息。
第5部分：代表性结果
成功的实验将准确呈现轴突损伤后恢复的细胞动态过程。成像后的胚胎应保持健康，无可见的退化现象，且具有强有力的心跳。轴突切断应造成精确的损伤，仅切断指定的轴突分支。周围其他轴突不应受到损伤，细胞死亡应极少。我们发现在约50%的实验中，轴切位点正上方的一个表皮细胞会发生死亡。如果观察到更广泛的损伤，应按照讨论部分所述优化双光子实验方案。
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讨论
我们已采用所述方法精确切断外周感觉轴突，并直接观察活体斑马鱼胚胎中的轴突发芽再生过程。在斑马鱼中进行长期延时共聚焦成像可用于在体（in vivo）观察多种发育过程。文中描述的双光子轴突切断技术可根据多种不同的实验目标进行调整。我们曾采用相同的基本方法，通过将激光聚焦于细胞体而非外周轴突分支，实现了对整个三叉神经感觉神经元胞体的消融。任何可通过荧光识别的细胞类型，均可利用飞秒激光的聚焦能量实现精确损伤或消融。此前在其他多个生物系统中利用脉冲激光造成局部损伤或细胞消融的研究4,5,6，启发了我们进一步完善斑马鱼体系中的这些技术。在对照实验中，我们证实轴突切断具有极高的精确性：即使相邻轴突属于同一细胞的分支，我们也从未对其造成损伤；仅偶尔损伤紧邻轴突的上皮细胞。这种特异性可归因于双光子激光激发的强度随离焦距离呈平方反比衰减3,7。此外，由于激发态荧光分子释放的能量会参与光损伤过程，因此周围未标记的细胞更可能免受损伤。
损伤轴突所需的激光功率可能因激光设备的设置、组织深度以及实验目的的不同而有所变化。如果需要损伤胚胎中更深层的...
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致谢
我们感谢 Mark Terasaki 在使用双光子显微镜制造局部组织损伤方面的初步建议，感谢 Kathy Joubin 在延时成像样品安装方面的建议，以及感谢 Sagasti 实验室和 Portera-Cailliau 实验室的讨论与帮助。最初的实验由 AS 作为马萨诸塞州伍兹霍尔海洋生物实验室的 Grass Foundation 研究员完成。Sagasti 实验室的工作得到了 Whitehall 基金会、Klingenstein 基金会以及生物科学领域 Burroughs Wellcome 基金职业奖的资助。
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参考文献
- Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors. Curr Biol. 15, 804-814 (2005).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Sacconi, L. In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).
- Yanik, M. F. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432, 822-822 (2004).
- Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. Mechanisms of laser cellular microsurgery. Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).
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重印与许可
