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第1部分：斑马鱼胚胎的长期成像固定
- 准备1%低熔点琼脂糖溶液用于包埋。将琼脂糖溶于去离子水中，微波加热溶解后分装至小管中，并置于42摄氏度的加热块中保存。
- 选择用于成像的胚胎，并用镊子轻轻撕开绒毛膜以去除。可在受精后22-24小时（hpf）将胚胎置于含5% PTU的林格氏液中，以抑制色素形成。这有助于提高成像清晰度，对于执行感觉轴突的双光子轴突切断实验至关重要。若允许自然色素形成，则在双光子显微镜下自体荧光会遮蔽轴突。斑马鱼用林格氏液含有116 mM NaCl、2.9 mM KCl、1.8 mM CaCl2 和 5 mM HEPES，pH 7.2。
- 通过向PTU林格氏液中加入约0.02%三卡因对胚胎进行麻醉。在继续操作前，需确认动物对触碰无反应。
- 通过在玻璃或聚四氟乙烯环的一侧涂抹真空脂，将其固定在盖玻片上，以制备长期成像用培养室。
- 用玻璃移液管将一个胚胎转移至42摄氏度的琼脂糖溶液中，注意避免带入过多PTU林格氏液，然后将胚胎连同一滴琼脂糖转移至已准备好的盖玻片上。
- 在琼脂糖凝固过程中将胚胎调整至所需位置。请注意，操作完成后需将成像室翻转，使盖玻片成为顶部表面。
- 若使用电动载物台并需同时对多个位置成像，请对每个胚胎重复步骤1.4–1.6。
- 待琼脂糖完全凝固后，向环内加入含0.02%三卡因的PTU林格氏液。
- 在环的另一侧涂抹真空脂，然后用载玻片覆盖环。将密封的成像室翻转。这些成像室可用于正置或倒置显微镜的成像。
第二部分：使用定制的双光子显微镜结合Chameleon钛宝石激光器进行双光子轴突切割
- 准备成像。将固定好的胚胎置于显微镜载物台上的载玻片夹中。使用40倍（0.8 NA）水镜聚焦于其中一个胚胎。打开激光器。我们已能够使用以下参数稳定地观察并损伤表达GFP的神经元。为在不造成损伤的功率下观察轴突，请将激光波长设为910纳米（nm），功率设为30毫瓦（mW；所列功率值为样品处的实际功率）。启动成像软件。我们使用Karel Svoboda实验室开发的ScanImage软件2, 3。
- 按下聚焦按钮，使用双光子激光扫描胚胎，定位需要进行轴突切断的轴突，并采集该轴突的图像。标记Z轴扫描的起始与终止位置，获取图像，并对Z轴图像序列生成最大强度投影图。
- 将目标轴突分支区域放大至70倍，并停止扫描。将样品处的激光功率提高至损伤性功率180 mW，然后用激光进行一次单次扫描。我们通过将Z轴切片数设为1并点击“Grab”来实现此操作。该操作应足以切断轴突。有关针对您的显微镜系统和实验目标优化该步骤的方法，请参见讨论部分。
- 缩小倍数，将激光功率调回30 mW，并采集图像。
第3部分：在蔡司510共聚焦/双光子显微镜上进行双光子轴突切割
- 将固定好的胚胎放置于载物台上，使用25倍水镜或其他合适的物镜将其调至焦点。
- 在多通道模式下开启双光子激光（910 nm）和氩离子激光（488 nm），以便可在两者之间切换。尽管两种激光均用于检测GFP，但双光子发射以红色显示，而氩离子激光发射以绿色显示，以区分二者。
- 使用氩离子激光识别待损伤的轴突。在Z轴设置中标记第一和最后一个光学切片。采集共聚焦图像，并对Z轴图像序列生成最大投影图。
- 选择待损伤的轴突区域，并将该区域调至焦点。关闭氩离子激光，开启双光子激光。以约9%透射强度的双光子激光扫描样本，确保轴突仍处于焦点位置。
- 点击“停止”按钮，以启用裁剪工具。使用裁剪功能放大至目标区域。通常放大至约70倍（可在“模式”选项卡下查看放大倍数）。在“通道”选项卡下，将双光子激光的强度从约9%透射调整至15–20%透射。
- 为切断轴突，按下“快速XY”按钮约1秒钟，然后按停止按钮以避免过度损伤。若操作成功，轴突应呈现为弥散的碎片状。
- 为确认轴突已受损，切换回488 nm氩离子激光，采集另一幅共聚焦图像，并生成最大投影图。
第4部分：在Zeiss LSM 510上进行共聚焦延时成像
- 准备成像。如果使用加热载物台，请务必提前至少30分钟开启。将固定好的胚胎置于显微镜载物台支架上。使用所需的空气物镜对其中一个胚胎进行调焦。我们使用的是20倍、0.5数值孔径（NA）的物镜。打开蔡司LSM 510成像软件，开启相应的激光器并设置所需的配置。接下来将详细介绍使用蔡司LSM Multi Time软件进行长期成像的详细方案。这些方法可根据您的显微镜和成像软件进行相应调整。
- 在Multi Time窗口中定义第一个胚胎的位置和配置。打开扫描、载物台和Multi Time窗口。在扫描窗口中启用快速扫描模式。移动载物台至所需的XY位置。在扫描窗口中标记第一个和最后一个Z位置。按下“Stop”，然后按下“Mid”（同样在扫描窗口中）。等待中间Z层面扫描完成后，点击载物台窗口中的“Mark Position”（标记位置）。如果仅对一个胚胎成像，请在Multi Time窗口中点击“Single Location”（单个位置）选项卡。点击“Replace XYZ”，然后点击“Save Configuration”（保存配置）。当提示是否覆盖先前配置时，选择确认。随后进入步骤4.4。如果使用的是电动载物台，可设置多个位置以对多个胚胎进行成像。此时应在定义第一个位置的XYZ和配置前，选择“Multiple Locations”（多个位置）选项卡。同时，请确保“Multiple Locations”选项卡下方的下拉菜单处于“Location 1”（位置1），且配置部分的下拉菜单显示为“multi loc 1”，然后再点击“Save Configuration”。
- 在Multi Time窗口中定义其余胚胎的位置和配置。定位下一个胚胎，按下快速扫描，将载物台移至所需的XY位置，并在扫描窗口中标记第一个和最后一个Z位置。按下“Stop”，然后按下“Mid”。等待中间Z层面扫描完成后，点击载物台窗口中的“Mark Position”。点击“Replace XYZ”。检查“Multiple Locations”选项卡下方的下拉菜单是否为“Location 2”，且配置部分的下拉菜单是否显示为“multi loc 2”，然后点击“Save Configuration”。当提示是否覆盖先前配置时，选择确认。对剩余胚胎重复此过程。
- 在Multi Loc窗口中设置图像采集参数。在“List of Blocks”（区块列表）部分选择“GR-G-L”选项，然后输入所需的组重复次数，即共聚焦显微镜在每个位置采集图像的次数。在“Parameters”（参数）部分输入所需的等待间隔时间，即一次成像重复开始到下一次成像重复开始之间的时间间隔。在配置部分选择“ZStackXY”。在底部区域输入基础文件名。点击“Select Image DB”并选择您的mdb文件。点击“Options”（选项）按钮，选择用于保存临时文件的mdb文件夹。勾选“keep final image open”（保持最终图像打开）、“save final image”（保存最终图像）和“middle of the z stack”（Z堆栈中间层面）。选择等待间隔时间。点击“OK”关闭选项窗口。点击“start time”（开始时间）。在整个成像过程中保持Multi Time窗口处于打开状态。
- 分析数据。当延时成像完成后，Multi Time软件会将所有临时文件汇总为每个位置的汇总文件。如果需要在成像完成前停止拍摄，请务必点击“Finish”（完成）而非“Stop”（停止），以确保生成汇总文件。临时文件和汇总文件应自动保存至指定的mdb文件夹。在LSM软件菜单中，点击“3D View”（三维视图），然后选择“Projection”（投影）。在下拉菜单中选择您的汇总文件后，点击“Apply”（应用），这将为每个共聚焦图像生成Z堆栈的最大强度投影。在LSM软件菜单中点击“File”（文件），然后选择“Export”（导出），将最大强度投影保存为一系列tif文件。随后可使用ImageJ或QuickTime Pro将这些tif文件序列合成为视频。可使用图像分析软件（例如MicroBrightfield公司的NeuroLucida）对LSM图像中的轴突进行三维追踪，以获得有关轴突形态的详细定量信息。
第5部分：代表性结果
成功的实验将准确呈现轴突损伤后恢复的细胞动态过程。成像后的胚胎应保持健康，无可见的退化现象，且具有强有力的心跳。轴突切断应造成精确的损伤，仅切断指定的轴突分支。周围其他轴突不应受到损伤，细胞死亡应极少。我们发现在约50%的实验中，轴切位点正上方的一个表皮细胞会发生死亡。如果观察到更广泛的损伤，应按照讨论部分所述优化双光子实验方案。