我们介绍了如何利用全内反射显微镜和落射荧光显微镜，在培养的星形胶质细胞中检测近膜区和全细胞内的钙离子动态变化。
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本文内容
摘要
摘要
大脑中含有胶质细胞。星形胶质细胞是一种胶质细胞，长期以来被认为仅为神经元提供被动的支持作用。然而，越来越多的证据表明，星形胶质细胞也可能通过与神经元的功能性相互作用，主动参与大脑功能的调控。然而，星形胶质细胞生物学中的许多基本方面仍存在争议、不明确和/或缺乏实验探索。其中一个重要的问题是星形胶质细胞内钙瞬变的动力学特性。这一问题具有重要意义，因为钙离子已被公认为重要的第二信使，且已有研究提出，星形胶质细胞内钙浓度的升高可能触发其释放神经递质。然而，目前尚无任何详细或令人满意的关于星形胶质细胞近质膜区域钙信号传导的描述。全内反射荧光（TIRF）显微镜是一种强大的工具，可用于分析活细胞质膜约100 nm范围内的生理相关信号事件。在此，我们使用TIRF显微镜，并描述如何几乎同时监测近质膜区域及细胞内全局钙动力学。对该方法的进一步优化和系统性应用，有望揭示星形胶质细胞钙信号传导的精确细节。深入理解星形胶质细胞钙动力学可能为阐明星形胶质细胞与神经元是否、如何、何时以及为何发生钙依赖性功能相互作用提供基础。
星形胶质细胞，钙信号，全内反射荧光显微镜，神经元，胶质细胞，第二信使，活细胞成像，质膜，钙瞬变，功能性相互作用
方案
实验步骤
实验步骤包括两个关键部分，以下将分步进行描述。
第1部分：制备海马星形胶质细胞培养物
简而言之，混合型海马星形胶质细胞-神经元培养物采用一种成熟的方案制备1,2,3。我们对步骤进行了优化，以获得健康的培养星形胶质细胞。以下所列所有操作均须在无菌环境中进行，例如超净工作台内。
准备盖玻片
- 22 mm 盖玻片 (VWR, 48380-068)
- 多聚-D-赖氨酸 (PDL, Sigma P0899)，分装 (1 mg/ml)
- 层粘连蛋白分装液 (20 μg/ml)：向 1 mg/ml 层粘连蛋白溶液 (Sigma L2020) 中加入 49 ml 无菌水，制成 1.2 ml 分装液，于 -20°C 保存
- 将PDL溶解于无菌水中（50 μg/ml）。
- 对盖玻片进行高压灭菌，用无菌水冲洗后放入PDL溶液中（100个盖玻片使用20 ml）。室温下静置过夜。
- 用无菌水替换PDL溶液（充分洗涤3次），然后干燥盖玻片并保存于4°C。
- 在接种星形胶质细胞的前一天，将单个盖玻片置于6孔板的无菌孔中（BD Bioscience的无菌多孔平底带盖培养板）。每张盖玻片上加入400 μl层粘连蛋白，于培养箱中孵育过夜，以避免蒸发。
解剖
解剖用培养基：
- 500 ml Earle's 平衡盐溶液（EBSS）（1X），液体（Invitrogen，14155-063）
- 5 ml HEPES 溶液（Sigma，H0887）
海马体培养基：
- 412.5 ml 最低必需培养基（MEM）(1X)，液体，含 Earle's 盐，不含 L-谷氨酰胺和酚红（Invitrogen，51200-038）
- 10 ml 葡萄糖（Sigma，D-(+)-无水葡萄糖 SIGMA ULTRA G7528），1 M 溶于 MEM
- 5 ml 青霉素-链霉素溶液（Invitrogen，15140-122）
- 5 ml 丙酮酸钠溶液（Sigma，S8636）
- 12.5 ml HEPES 溶液，1 M（Sigma，H0887）
- 5 ml N-2 添加剂（100X），液体（Invitrogen，17502-048）
- 50 ml 马血清，经热灭活（Invitrogen，26050-088）
木瓜蛋白酶溶液：
- 向 Worthington PAPAIN-022 小瓶（LK003178；终浓度 20 U/ml）中加入 5 ml 解离培养基，并在 37°C 下孵育 60 分钟。
- 根据国家法规及本地机构动物护理与使用委员会审核批准的指南，处死出生后第1天（P1）的大鼠幼崽（通常为2只）。
- 去除皮肤和颅骨，将脑组织置于盛有冷解剖液的培养皿中。
- 去除脑膜，分离两侧半球并解剖出海马体。
- 将海马体切成约1×1 mm的组织块，在37°C下用木瓜蛋白酶溶液消化11–13分钟。
- 待组织块沉降后，小心吸除木瓜蛋白酶，并加入5 ml海马体培养基以彻底清除酶残留。重复此步骤一次，最后用海马体培养基重悬细胞（2 ml）。
- 用三支经火焰抛光、内径依次减小（1000 μm、约500 μm和约300 μm）的移液管，轻轻吹打细胞约5次，直至无细胞团块残留。
- 吹打完成后，将细胞悬液通过细胞筛网（孔径70 μm，BD Bioscience）过滤。取10 μl悬液进行细胞计数，并调整海马体培养基体积，使细胞密度达到400000个/ml。
- 吸除盖玻片上的多聚赖氨酸溶液，在盖玻片未干燥前，每张盖玻片接种200 μl细胞悬液。
- 将盖玻片置于培养箱中孵育60分钟，使细胞贴壁，随后每孔加入2 ml海马体培养基。
- 次日，吸除旧的海马体培养基以去除死亡细胞和碎片，并每孔加入2 ml预热的新鲜海马体培养基。
维持
Neurobasal 培养基：
- 500 ml 神经基础培养基（Neurobasal，Invitrogen，12348-017）
- 10 ml B27 无血清添加剂（Invitrogen，17504-044）
- 5 ml 青霉素-链霉素溶液（Penicillin-Streptomycin，Invitrogen，15140-122）
- 1.25 ml L-谷氨酰胺溶液（L-glutamine，Invitrogen，25030-149）
从接种后第四天开始，每周两次用神经基础培养基喂养星形胶质细胞-神经元共培养物。将培养基在通风的烧瓶中预先在培养箱中孵育约30分钟，以平衡温度和CO2。
第二部分：钙成像
海马记录缓冲液：110 mM NaCl，5.4 mM KCl，1.8 mM CaCl2，0.8 mM MgCl2，10 mM D-葡萄糖，10 mM HEPES（所有化学试剂均来自Sigma），pH 7.4（用NaOH调节）。
将钙离子指示剂染料载入星形胶质细胞
- 将培养物放入6孔板的一个孔中，孔内含有2 ml海马记录缓冲液，其中加入2.5 μM Fluo-4, AM（Invitrogen, F-14217）和0.05% Pluronic® F-127的20% DMSO溶液（Invitrogen, P-3000MP），在室温下孵育10-30分钟。
- 移除Fluo-4溶液，用海马记录缓冲液洗涤盖玻片3次，并在室温下孵育30分钟。
- 将盖玻片放置于灌流 chamber 上，用镜头清洁液清洁盖玻片的另一面。
- 在物镜上滴加一滴浸油（Cargille公司Immersion Oil TYPE DF），然后将chamber（Warner Instruments的25 mm圆形盖玻片开放式chamber）置于显微镜（Olympus IX71）载物台上。
- 使用透射光观察细胞形态，并调节至清晰对焦。然后使用单色光发生器（TILL Vision的Polychrome V）提供488 nm激发光，观察星形胶质细胞中Fluo-4的荧光信号是否均匀且可检测。
- 使用落射照明（EPI）和全内反射荧光（TIRF）照明法测量星形胶质细胞中的钙信号。
全内反射荧光显微镜
简而言之，我们使用配备 Andor IXON DV887DCS EMCCD 相机的 Olympus IX71 显微镜。激发光控制与图像采集通过 TILLVision 软件实现。454/488/515 nm 氩离子激光器（100 mW）和 442 nm 固态激光器（45 mW）的光束通过 TILL Polyline 激光合束器、TIRF 双通光路聚光镜以及声光可调滤波器及其控制器（AOTF；以上均来自 TILL Photonics）进行合并与调控，随后经由 Kineflex 宽带光纤导入 TIRF 聚光镜。我们采用 Olympus 60X 1.45 NA 物镜实现全内反射荧光（TIRF）。针对每个星形胶质细胞，调整相机增益以获得最佳信噪比图像。TIRF 显微镜的背景知识与基本原理已有近期综述4, 5。我们所使用的大部分光学元件购自 TILL Photonics，该公司现为安捷伦科技（Agilent Technologies）的一部分（http://www.till-photonics.com/）。TIR 穿透深度可通过以下公式计算。
d = 穿透深度
n1 = 玻璃的折射率
n2 = 细胞的折射率
a = 入射角
NAi = 入射数值孔径
为了确保激光在全内反射荧光（TIRF）成像中处于最佳对准状态，我们发现观察100 nm荧光微球（Invitrogen, F8803）非常有用。我们展示了使用宽场（EPI）和TIRF显微镜拍摄的微球静态图像和视频。在TIRF模式下，可观察到信噪比显著提高，且微球呈现布朗扩散。我们发现定期（约每周一次）通过TIRF显微镜观察100 nm微球的行为有助于确认是否实现了最佳TIRF成像，从而避免因入射角未达到临界角α而产生的非理想斜入射照明（见图1）。
G蛋白偶联受体激动剂的应用
星形胶质细胞表达多种Gq偶联受体6, 7，包括代谢型谷氨酸受体和P2Y受体（激动剂：ATP、ADP）。这些受体的激活可导致星形胶质细胞内钙离子水平显著升高。例如，在向星形胶质细胞施加ATP（30 μM）时，可明显观察到细胞内钙离子浓度的上升8-10。我们使用华纳仪器公司（Warner Instruments）生产的VC-77SP快速溶液切换系统（Fast-Step灌流系统）（http://www.warneronline.com/index.cfm）。利用该方法，溶液可在不到约10 ms的时间内完成切换。
图1. 成像系统的示意图与照片。A. 显示安装在气浮平台上的显微镜照片；B. 显示激光组件、控制器和光束盒的照片。C. 显示用于成像的培养腔室安装在显微镜载物台上的照片。左侧可见快速灌流装置（连同步进电机和theta导管），右侧可见Axopatch 200A放大器的头级。示意图描绘了系统中的光路以及全内反射荧光（TIRF）的实现方式。激光聚焦于60倍、数值孔径1.45的物镜的后焦平面，并将其位置调节至偏离中心，使光束以临界角α进入浸油。此时光束发生全内反射，并在折射率较低的介质中以距离λ衰减（见正文中的公式）。在此情况下，该介质为星形胶质细胞周围的记录缓冲液以及星形胶质细胞本身。结果是仅对质膜约100 nm范围内的分子进行光学激发（从而实现成像）。在细胞示意图中，这表现为绿色的“被激发”膜受体，而细胞内部或细胞顶面的分子则未被激发。Steyer和Almers4已对TIRF显微技术进行了全面阐述。
图2. 使用宽场落射荧光（EPI）和全内反射荧光（TIRF）显微镜获取的100 nm荧光微球图像。A. 显示包含数十个100 nm荧光微球的视野的EPI图像。红色箭头指向已沉降在玻璃盖玻片上的微球，而蓝色箭头指向在水中扩散的微球。B. 显示与A中相同视野的TIRF图像。在此图像中，仅可见由红色箭头指示的已贴附的微球，因为这些微球已沉降在玻璃盖玻片上，因而位于约100 nm的隐逝场范围内。A图中由蓝色箭头指示的微球不在该区域内，因此在TIRF图像中不可见。下方的图像显示了图像的三维渲染图。显然，当通过TIRF显微镜观察时，处于隐逝场内的微球信噪比显著提高。事实上，这些图像中EPI的信噪比为7.1 ± 0.6，而TIRF的信噪比为20 ± 0.7。
图 3. 使用 EPI 和 TIRF 显微镜采集的星形胶质细胞加载 Fluo-4 钙离子指示剂染料后的图像。A. 一个包含五个星形胶质细胞的视野的 EPI 图像。B. 与 A 相同视野的 TIRF 图像。请注意，A 和 B 中的图像存在显著差异。这是由于 TIRF 照明仅对紧贴玻璃盖玻片的质膜区域进行成像。下方图像显示了通过 EPI 和 TIRF 显微镜观察到的 ATP 诱发的细胞内钙瞬变。
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讨论
众所周知，星形胶质细胞会表现出细胞内钙水平的升高。这种钙升高可自发发生，也可由神经元活动或施加激动剂激活星形胶质细胞表面受体所触发11。一个重要的且存在争议的问题是：星形胶质细胞的细胞内钙升高是否能够触发信号分子的释放，从而激活神经元上的受体11, 12。这一问题存在争议，是因为已有研究既提供了支持也提供了反对这一观点的证据，Haydon7, 13 和 McCarthy11 实验室的综述对此进行了重点阐述。根据我们近期在脑片成像和电生理方面的研究数据，我们认为，在设计新的、基于假设的实验以明确星形胶质细胞如何影响神经元之前，必须首先更深入且精确地理解星形胶质细胞的钙动力学14。在本视频文章中，我们介绍了一种简单的方法，可在培养的星形胶质细胞中近乎同时地成像近质膜区域和全细胞范围内的细胞内钙变化。全内反射荧光（TIRF）显微镜的一项不可避免的技术要求是必须使用培养细胞，因为这些细胞需贴附于玻璃盖玻片上，处于衰逝场的穿透深度范围内3。值得注意的是，与体内状态相比，培养状态下的星形胶质细胞会发生基因表达谱的改变<...
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致谢
本研究由日本上原纪念基金会（授予 ES）以及怀特霍尔基金会、国家神经疾病与中风研究所和斯坦因-奥本海默捐赠基金奖（授予 BSK）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| VWR® 微型圆形盖玻片，1 号 | 工具 | VWR international | 48380-068 | |
| 聚-D-赖氨酸氢溴酸盐 | 试剂 | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| 来自 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤基底膜的层粘连蛋白 | 试剂 | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Earle’s 平衡盐溶液 (EBSS) (1X)，液体 | 试剂 | Invitrogen | 14155-063 | |
| 最低必需培养基 (MEM) (1X)，液体，含 Earle’s 盐，不含 L-谷氨酰胺和酚红 | 试剂 | Invitrogen | 51200-038 | |
| 青霉素-链霉素溶液，液体 | 试剂 | Invitrogen | 15140-122 | |
| 丙酮酸钠溶液 | 试剂 | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| HEPES 溶液 1 M | 试剂 | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| N-2 补充剂 (100X)，液体 | 试剂 | Invitrogen | 17502-048 | |
| 马血清，经热灭活 | 试剂 | Invitrogen | 26050-088 | |
| PAPAIN-022 | 试剂 | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Neurobasal™ 培养基 (1X)，无酚红液体 | 试剂 | Invitrogen | 12348-017 | |
| B-27 无血清补充剂 (50X)，液体 | 试剂 | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-谷氨酰胺-200 mM (100X)，液体 | 试剂 | Invitrogen | 25030-149 | |
| 细胞筛 | 工具 | BD Biosciences | 352350 | |
| BD Falcon 多孔平底培养板，带盖，无菌 | 工具 | BD Biosciences | 353046 | |
| NaCl | 试剂 | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | 试剂 | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| CaCl2 六水合物 | 试剂 | Sigma-Aldrich | 21108 | |
| MgCl2 六水合物 | 试剂 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| HEPES 游离酸 | 试剂 | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| D-(+)-葡萄糖 | 试剂 | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Fluo-4, AM 1 mM DMSO 溶液 | 试剂 | Invitrogen | F-14217 | |
| Pluronic® F-127 20% DMSO 溶液 | 试剂 | Invitrogen | P-3000MP | |
| 浸油 TYPE DF | 显微镜 | Cargill Labs | 16242 | |
| 适用于 25 mm 圆形盖玻片的开放式腔室，体积 100 μl | 工具 | Warner Instruments | 64-0362 (RC-21BDW) | |
| Series 20 腔室用 P-2 平台，非加热型 | 工具 | Warner Instruments | 64-0278 (P-2) | |
| FluoSpheres 羧基修饰微球，0.1 μm，黄绿色荧光 (505/515)，2% 固体含量 | 试剂 | Invitrogen | F8803 |
参考文献
- Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo. Nature Methods. 5, 87-93 (2008).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51, 773-786 (2006).
- Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J Vis Exp. 19, (2008).
- Steyer, J. A., Almers, W. A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 268-275 (2001).
- Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14151-14156 (2007).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signalling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
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- Bowser, D. N., Khakh, B. S. ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks. J Neurosci. 24, 8606-8620 (2004).
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- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Vesicular ATP is the predominant cause of intercellular calcium waves in astrocytes. J Gen Physiol. 129, 485-491 (2007).
- Agulhon, C. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
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- Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons. J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).
- Cahoy, J. D. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28, 264-278 (2008).
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