测量星形胶质细胞中近质膜及全细胞内钙动力学

摘要

我们介绍了如何利用全内反射显微镜和落射荧光显微镜，在培养的星形胶质细胞中检测近膜区和全细胞内的钙离子动态变化。

摘要

大脑中含有胶质细胞。星形胶质细胞是一种胶质细胞，长期以来被认为仅为神经元提供被动的支持作用。然而，越来越多的证据表明，星形胶质细胞也可能通过与神经元的功能性相互作用，主动参与大脑功能的调控。然而，星形胶质细胞生物学中的许多基本方面仍存在争议、不明确和/或缺乏实验探索。其中一个重要的问题是星形胶质细胞内钙瞬变的动力学特性。这一问题具有重要意义，因为钙离子已被公认为重要的第二信使，且已有研究提出，星形胶质细胞内钙浓度的升高可能触发其释放神经递质。然而，目前尚无任何详细或令人满意的关于星形胶质细胞近质膜区域钙信号传导的描述。全内反射荧光（TIRF）显微镜是一种强大的工具，可用于分析活细胞质膜约100 nm范围内的生理相关信号事件。在此，我们使用TIRF显微镜，并描述如何几乎同时监测近质膜区域及细胞内全局钙动力学。对该方法的进一步优化和系统性应用，有望揭示星形胶质细胞钙信号传导的精确细节。深入理解星形胶质细胞钙动力学可能为阐明星形胶质细胞与神经元是否、如何、何时以及为何发生钙依赖性功能相互作用提供基础。 星形胶质细胞，钙信号，全内反射荧光显微镜，神经元，胶质细胞，第二信使，活细胞成像，质膜，钙瞬变，功能性相互作用

方案

实验步骤

实验步骤包括两个关键部分，以下将分步进行描述。

第1部分：制备海马星形胶质细胞培养物

简而言之，混合型海马星形胶质细胞-神经元培养物采用一种成熟的方案制备^1,2,3。我们对步骤进行了优化，以获得健康的培养星形胶质细胞。以下所列所有操作均须在无菌环境中进行，例如超净工作台内。

准备盖玻片

• 22 mm 盖玻片 (VWR, 48380-068)
• 多聚-D-赖氨酸 (PDL, Sigma P0899)，分装 (1 mg/ml)
• 层粘连蛋白分装液 (20 μg/ml)：向 1 mg/ml 层粘连蛋白溶液 (Sigma L2020) 中加入 49 ml 无菌水，制成 1.2 ml 分装液，于 -20°C 保存

1. 将PDL溶解于无菌水中（50 μg/ml）。
2. 对盖玻片进行高压灭菌，用无菌水冲洗后放入PDL溶液中（100个盖玻片使用20 ml）。室温下静置过夜。
3. 用无菌水替换PDL溶液（充分洗涤3次），然后干燥盖玻片并保存于4°C。
4. 在接种星形胶质细胞的前一天，将单个盖玻片置于6孔板的无菌孔中（BD Bi....

讨论

众所周知，星形胶质细胞会表现出细胞内钙水平的升高。这种钙升高可自发发生，也可由神经元活动或施加激动剂激活星形胶质细胞表面受体所触发¹¹。一个重要的且存在争议的问题是：星形胶质细胞的细胞内钙升高是否能够触发信号分子的释放，从而激活神经元上的受体^{11, 12}。这一问题存在争议，是因为已有研究既提供了支持也提供了反对这一观点的证据，Haydon^{7, 13} 和 McCarthy¹¹ 实验室的综述对此进行了重点阐述。根据我们近期在脑片成像和电生理方面的研究数据，我们认为，在设计新的、基于假设的实验以明确星形胶质细胞如何影响神经元之前，必须首先更深入且精确地理解星形胶质细胞的钙动力学¹⁴。在本视频文章中，我们介绍了一种简单的方法，可在培养的星形胶质细胞中近乎同时地成像近质膜区域和全细胞范围内的细胞内钙变化。全内反射荧光（TIRF）显微镜的一项不可避免的技术要求是必须使用培养细胞，因为这些细胞需贴附于玻璃盖玻片上，处于衰逝场的穿透深度范围内³。值得注意的是，与体内状态相比，培养状态下的星形胶质细胞会发生基因表达谱的改变<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
VWR® 微型圆形盖玻片，1 号	工具	VWR international	48380-068
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	试剂	Sigma-Aldrich	P0899
来自 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤基底膜的层粘连蛋白	试剂	Sigma-Aldrich	L2020
Earle’s 平衡盐溶液 (EBSS) (1X)，液体	试剂	Invitrogen	14155-063
最低必需培养基 (MEM) (1X)，液体，含 Earle’s 盐，不含 L-谷氨酰胺和酚红	试剂	Invitrogen	51200-038
青霉素-链霉素溶液，液体	试剂	Invitrogen	15140-122
丙酮酸钠溶液	试剂	Sigma-Aldrich	S8636
HEPES 溶液 1 M	试剂	Sigma-Aldrich	H0887
N-2 补充剂 (100X)，液体	试剂	Invitrogen	17502-048
马血清，经热灭活	试剂	Invitrogen	26050-088
PAPAIN-022	试剂	Worthington Biochemical	LK003178
Neurobasal™ 培养基 (1X)，无酚红液体	试剂	Invitrogen	12348-017
B-27 无血清补充剂 (50X)，液体	试剂	Invitrogen	17504-044
L-谷氨酰胺-200 mM (100X)，液体	试剂	Invitrogen	25030-149
细胞筛	工具	BD Biosciences	352350
BD Falcon 多孔平底培养板，带盖，无菌	工具	BD Biosciences	353046
NaCl	试剂	Sigma-Aldrich	S7653
KCl	试剂	Sigma-Aldrich	P3911
CaCl2 六水合物	试剂	Sigma-Aldrich	21108
MgCl2 六水合物	试剂	Sigma-Aldrich	M2670
HEPES 游离酸	试剂	Sigma-Aldrich	H3375
D-(+)-葡萄糖	试剂	Sigma-Aldrich	G7528
Fluo-4, AM 1 mM DMSO 溶液	试剂	Invitrogen	F-14217
Pluronic® F-127 20% DMSO 溶液	试剂	Invitrogen	P-3000MP
浸油 TYPE DF	显微镜	Cargill Labs	16242
适用于 25 mm 圆形盖玻片的开放式腔室，体积 100 μl	工具	Warner Instruments	64-0362 (RC-21BDW)
Series 20 腔室用 P-2 平台，非加热型	工具	Warner Instruments	64-0278 (P-2)
FluoSpheres 羧基修饰微球，0.1 μm，黄绿色荧光 (505/515)，2% 固体含量	试剂	Invitrogen	F8803