本文介绍了一种在固体培养基上以紫外线灭活的细菌作为食物来源饲养线虫时，测定其寿命的通用实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
衰老是一种退行性过程，其特征是细胞组分和细胞器进行性退化，最终导致死亡。线虫Caenorhabditis elegans已成为研究衰老生物学的主要模型。由于几乎所有生物系统都会随着年龄增长而发生功能衰退，因此寿命是衡量整体衰老速率的主要关注终点。在线虫中，寿命通常定义为动物对外界刺激保持反应能力的天数。线虫可在液体培养基中或平板上的固体培养基中培养，且已有技术可用于在两种条件下测定其寿命。本文介绍一种通用方案，用于测定在线虫固体生长培养基上培养并饲喂经紫外线灭活细菌的线虫的寿命。这些步骤可轻松调整，以适用于多种常见条件下的寿命测定，包括饲喂活菌、饮食限制和RNA干扰。
方案
第1部分：制备线虫生长培养基（NGM）平板
本部分介绍用于寿命实验的固体NGM平板的制备。基本的寿命实验需要两种类型的平板：标准NGM平板，不含任何添加剂；以及Amp/FUDR平板，在NGM中添加氨苄青霉素（Amp）和氟脱氧尿苷（FUDR）。氨苄青霉素用于防止外来细菌污染。FUDR可抑制细胞分裂，减少卵的产生，并阻止卵孵化。在寿命分析中使用FUDR不会影响成虫的寿命，同时避免了每隔几天转移线虫以将其与发育中的幼虫分离的需要。这两种平板均接种大肠杆菌OP50（E. coli OP50），随后通过紫外线照射杀死细菌。
- 制备 NGM（配方及储存注意事项见第 5 节），并标记培养皿。每 10 mL NGM 需要 1 个 60 mm 培养皿。如果使用的是预先制备好的固体 NGM，请继续进行步骤 1.2；如果使用的是刚高压灭菌的 NGM，则跳至步骤 1.4。
- 将固体 NGM 放入微波炉中，以高火每次加热 30 秒，直至完全融化。每次加热后轻轻摇晃培养基，防止压力气泡积聚。
- 将液态 NGM 置于 55 °C 水浴或实验台上冷却。
- 当 NGM 温度降至 55 °C 时，每 100 mL NGM 中加入 33 µL 的 150 mM FUDR 和 100 µL 的 100 mg/mL 氨苄青霉素（用于制备 Amp/FUDR 平板），并轻轻摇晃混合。若制备不含额外药物的 NGM 平板，则直接进入....
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讨论
秀丽隐杆线虫（C. elegans）的寿命遗传调控已被广泛研究，这主要得益于其寿命测定操作简便且周期短。本文所讨论的实验方案为获得可重复的 C. elegans 寿命数据提供了基本框架，也可应用于其他相关线虫物种。2 通过一些简单的调整，这些操作步骤可被改造用于在多种不同条件下测定寿命。本文将介绍几种常见的变体方法，包括使用活细菌、RNA干扰（RNAi）、通过剥夺细菌实现饮食限制，以及无药物的NGM培养基条件。
该实验方案最常见的一个变体是使用活细菌来培养线虫。 这可以通过一些小的调整来实现。首先，改变在平板上接种细菌的步骤（步骤1.7至1.13）：无需将OP50菌液培养至饱和期，而是培养至对数中期，然后直接从液体培养物中吸取200 µL滴加到平板上。让细菌在平板上过夜生长，并省去紫外线照射步骤。同时，在含有FUDR的平板中也应去除氨苄青霉素。使用活细菌的一个优点是，由于细菌食物处于存活并持续生长状态，线虫无需频繁转移至新的平板。然而，活细菌作为食物的缺点在于OP50对秀丽隐杆线虫（C. elegans<.......
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致谢
本工作获得了Glenn/AFAR老年病学突破奖和美国国立卫生研究院（NIH）资助项目1R01AG031108-01对M. K.的支持。G. S. 获得了NIH培训资助项目P30AG013280的支持。M. K. 是艾里森医学基金会老年病学新学者。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 琼脂 | 试剂 | Fisher Scientific | DF0145-17-0 (214530) | |
| 氨苄青霉素 | 试剂 | MidSci | 0339 | |
| 胰蛋白胨 | 试剂 | Fisher Scientific | DF0123-17-3 (211705) | |
| 蛋白胨 | 试剂 | Fisher Scientific | DF0118-17-0 (211677) | |
| CaCl2 | 试剂 | Fisher Scientific | NC9699248 (1332-01) | |
| 羧苄青霉素 | 试剂 | Gold Biotechnology | C0109 | |
| 胆固醇 | 试剂 | Sigma-Aldrich | C75209 | |
| 氟脱氧尿苷（FUDR） | 试剂 | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG） | 试剂 | Gold Biotechnology | I2481C5 | |
| 磷酸氢二钾 | 试剂 | Fisher Scientific | 5087862 (3252-01) | |
| 磷酸二氢钾 | 试剂 | Fisher Scientific | 5087861 (3246-01) | |
| MgSO4 | 试剂 | Fisher Scientific | NC9561800 (2500-01) | |
| NaCl | 试剂 | Fisher Scientific | S251 | |
| Tris | 试剂 | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| 酵母提取物 | 试剂 | Fisher Scientific | DF0886-17-0 (288620) |
参考文献
- Wood, W. B. The Nematode Caenorhabditis elegans. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-16 (1988).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Dietary restriction by bacterial deprivation increases life span in wild-derived nematodes. Exp Gerontol. 43, 130-135 (2008).....
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