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方法文章

测量 秀丽隐杆线虫 固体培养基上的寿命测定

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DOI：

10.3791/1152

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2009年5月12日

 , 
1Department of Pathology, University of Washington, 2Molecular and Cellular Biology Program, University of Washington

本文内容

摘要

本文介绍了一种在固体培养基上以紫外线灭活的细菌作为食物来源饲养线虫时，测定其寿命的通用实验方案。

摘要

衰老是一种退行性过程，其特征是细胞组分和细胞器进行性退化，最终导致死亡。线虫Caenorhabditis elegans已成为研究衰老生物学的主要模型。由于几乎所有生物系统都会随着年龄增长而发生功能衰退，因此寿命是衡量整体衰老速率的主要关注终点。在线虫中，寿命通常定义为动物对外界刺激保持反应能力的天数。线虫可在液体培养基中或平板上的固体培养基中培养，且已有技术可用于在两种条件下测定其寿命。本文介绍一种通用方案，用于测定在线虫固体生长培养基上培养并饲喂经紫外线灭活细菌的线虫的寿命。这些步骤可轻松调整，以适用于多种常见条件下的寿命测定，包括饲喂活菌、饮食限制和RNA干扰。

方案

第1部分：制备线虫生长培养基（NGM）平板

本部分介绍用于寿命实验的固体NGM平板的制备。基本的寿命实验需要两种类型的平板：标准NGM平板，不含任何添加剂；以及Amp/FUDR平板，在NGM中添加氨苄青霉素（Amp）和氟脱氧尿苷（FUDR）。氨苄青霉素用于防止外来细菌污染。FUDR可抑制细胞分裂，减少卵的产生，并阻止卵孵化。在寿命分析中使用FUDR不会影响成虫的寿命，同时避免了每隔几天转移线虫以将其与发育中的幼虫分离的需要。这两种平板均接种大肠杆菌OP50（E. coli OP50），随后通过紫外线照射杀死细菌。

  1. 制备 NGM（配方及储存注意事项见第 5 节），并标记培养皿。每 10 mL NGM 需要 1 个 60 mm 培养皿。如果使用的是预先制备好的固体 NGM，请继续进行步骤 1.2；如果使用的是刚高压灭菌的 NGM，则跳至步骤 1.4。
  2. 将固体 NGM 放入微波炉中，以高火每次加热 30 秒，直至完全融化。每次加热后轻轻摇晃培养基，防止压力气泡积聚。
  3. 将液态 NGM 置于 55 °C 水浴或实验台上冷却。
  4. 当 NGM 温度降至 55 °C 时，每 100 mL NGM 中加入 33 µL 的 150 mM FUDR 和 100 µL 的 100 mg/mL 氨苄青霉素（用于制备 Amp/FUDR 平板），并轻轻摇晃混合。若制备不含额外药物的 NGM 平板，则直接进入步骤 1.5。
  5. 采用无菌操作技术，将 10 mL NGM 用移液器加入每个 60 mm 培养皿中。尽量避免产生气泡；若出现气泡，可用移液器吸头刺破。
  6. 将培养皿盖好后置于实验台上，使 NGM 凝固并干燥。若条件允许，建议在接种细菌前将平板放置 2 天，若急需使用，放置 1 天亦可。
  7. 在平板完成干燥的前一天，从 LB 琼脂平板上新鲜划线的 E. coli OP50 菌落中挑取单菌落，接种至液体 LB 培养基中。每 60 mm 平板应至少准备 1 mL 过夜培养的 OP50 菌液。
  8. 将 OP50 菌液置于 37 °C 摇床中过夜培养（菌液应达到饱和状态）。
  9. 以 3,500 g 离心 10 分钟，收集 OP50 菌体沉淀。
  10. 弃去上清液体积的 90%，用剩余液体重悬菌体，使菌液浓缩 10 倍。
  11. 用移液器将 100 µL 浓缩 10 倍的 OP50 菌液加至已凝固的 NGM 平板中央。如有需要，可轻轻旋转平板使菌液均匀铺展（理想情况下，菌液应覆盖 NGM 中央区域，但不接近培养皿边缘）。尽量避免移液器吸头接触 NGM 表面，因为培养基表面的划痕可能导致线虫钻入培养基内部。
  12. 将平板置于实验台上过夜，使细菌在固体 NGM 表面干燥（通常约需 24 小时）。
  13. 干燥后，使用足够剂量的紫外线照射平板表面，以抑制细菌生长。若使用 Stratagene UV Stratalinker 2400：
    • 将平板放入 Stratalinker 中，并取下皿盖
    • 关闭舱门并开启仪器
    • 按下“Energy”键
    • 使用数字键输入“9999”
    • 按下“Start”键
    • 平板将接受约 5 分钟的紫外线照射
  14. 经紫外线灭活细菌的平板可倒置存放于 4 °C，最长可保存 1 个月。

第二部分：进行定时产卵以获得年龄同步的动物群体

在本实验步骤中，我们将获得一批具有相同孵化日期的线虫群体。具体方法是让具有生殖活性的成虫在培养皿上产卵一段特定时间，随后使这些卵进行发育。

  1. （可选）将约20只年轻成虫线虫转移至不含FUDR的新鲜NGM平板上。将平板置于25 °C培养，使线虫繁殖并消耗完所有细菌食物。当细菌食物被耗尽后，新孵化的线虫将进入生长停滞的dauer阶段。根据最初转移至平板的线虫数量，大约一周内开始可见dauer幼虫。dauer幼虫可在接下来的一个月内用于后续实验步骤。
  2. （可选）将20至30只dauer幼虫转移至不含FUDR的新鲜NGM平板上。在有食物存在的情况下，dauer幼虫将在2天内恢复为具有生殖活性的成虫，并在25 °C条件下维持数天生殖活性。
  3. 将10至15只具有生殖活性的成虫转移至不含FUDR的新鲜NGM平板上。此平板称为定时产卵（TEL）平板。
  4. 将TEL平板置于25 °C培养6小时，以允许线虫有足够时间产卵。
  5. 从TEL平板上移除成虫。在移除成虫前可先肉眼检查平板上是否有卵。若线虫产卵数量不足，可将TEL平板在25 °C继续放置，总时长最多不超过24小时后再移除成虫。
  6. 将TEL平板转移至20 °C培养，直至卵孵化且线虫发育至L4幼虫阶段（对于野生型C. elegans通常需要2天，但发育缓慢表型的品系可能需要更长时间）。

第3部分：对动物进行寿命评分

在本部分中，我们对来自第2部分的年龄同步化线虫群体进行观察，直至其死亡。线虫维持在含氨苄青霉素/氟脱氧尿苷（Amp/FUDR）的培养板上，以防止产卵和细菌污染；当线虫对外界刺激无反应时，即判定为死亡。

  1. 将L4期幼虫转移至已接种的Amp/FUDR平板上。对于每种待测菌株或条件，通常设置2-3个平板，每个平板放置25-30条线虫。图1提供了C. elegans各生活阶段的参考图像。1
  2. 将Amp/FUDR平板置于20 °C环境中培养24小时。
  3. 24小时后，目视检查线虫、培养基和细菌状况。若出现以下任一情况，需将线虫转移至新的Amp/FUDR平板：
    • 线虫已摄食大部分细菌食物。在寿命实验早期，通常需要每周转移1至2次，以防止细菌被耗尽。
    • 存在大量幼虫。这通常表明线虫在转移时已为年轻成虫而非L4期幼虫，导致其在FUDR发挥作用前已产下部分卵。FUDR通常可阻止幼虫发育为成虫，但偶尔会有少数个体发育为成虫，从而与实验动物混淆。
    • 观察到活的或正在生长的细菌。通常情况下，氨苄青霉素（Amp）与紫外灭菌联用可确保实验中无活菌污染，但偶尔仍可能发生。
    • 培养基上出现真菌生长。若发现较早，通常可用移液器吸头或刮刀切除真菌区域；一旦真菌直径超过数毫米，通常更宜将线虫转移至新平板。
    • 使用解剖显微镜判断每条线虫是否存活。
    • 轻轻敲击平板。若线虫对敲击产生运动反应，则判定为存活。
    • 若线虫对平板敲击无反应，应放大观察其头部区域。
    • 用铂金接种针轻轻触碰线虫头部。若其头部无运动反应，则记为死亡。
    • 死亡线虫可从平板上移除。
  4. 记录日期以及存活和死亡线虫的数量。
  5. 将平板放回20 °C环境中。
  6. 每2至3天重复步骤3.3至3.6，直至所有线虫均死亡。

第4部分：代表性结果。

线虫寿命实验产生的原始数据是一份日期列表，其中包含每种测试品系在各时间点存活和死亡的线虫数量。通常将每天死亡的线虫数量进行倒推，以计算每天存活线虫的比例（图2A），并将该比例以图形方式绘制为生存曲线（图2B；定时产卵的当天记为第0天）。通过每天死亡的线虫数量，可计算出每只线虫的寿命，并进一步计算平均寿命和中位寿命，用于不同品系之间的比较。每天存活线虫的数量不直接用于寿命分析。在固体培养基上培养的线虫偶尔会发生“逃逸”现象，即爬到培养皿壁上或钻入培养基下方。每天存活线虫的数量可用于估算整个实验过程中逃逸的线虫总数。逃逸的线虫通常会被排除在分析之外。作为参考标准，野生型品系N2（C. elegans）在20 °C条件下以紫外灭活的细菌作为食物来源时，从卵开始计算的典型中位寿命约为25天。

第5部分：溶液

线虫生长培养基（NGM），100 mL：
混合：
0.3 gNaCl
0.25 g蛋白胨
2 g琼脂
121 °C 高压灭菌 40 分钟，冷却至 55 °C 后加入：
100 µL1 M MgSO4
100 µL5 mg/mL 胆固醇
100 µL1 M CaCl2
1.625 mL1.5 M KPi pH 6.0
液态 NGM 可立即用于倒平板，也可使其凝固后于室温长期保存
LB 培养基（Luria Broth），1L：
10 gBactoTryptone
5 g酵母提取物（Yeast Extract）
10 gNaCl
10 mL1 M Tris pH 8.0
1 L去离子水
高压灭菌后室温保存。
1 M MgSO4，300 mL：
73.95 gMgSO4
300 mL去离子水
高压灭菌后室温保存。
5 mg/mL 胆固醇，200 mL：
1 g胆固醇
200 mL100% 乙醇
过滤除菌，室温保存。
1 M CaCl2，500 mL：
27.75 gCaCl2
500 mL去离子水
过滤除菌，室温保存。
1.5 M KPi pH 6.0，1 L：
混合：
31.4 gKPi dibasic
179.6 gKPi monobasic
850 mL去离子水
边搅拌边加热，使 KPi 溶解。用 10 N NaOH 调节 pH 至 6.0。
加去离子水定容至 1 L。
高压灭菌后室温保存。
1 M Tris，pH 8.0：
60.57 gTris
400 mL去离子水
用 HCl 调节 pH 至 8.0。
加去离子水定容至 500 mL。
过滤除菌后室温保存。
150 mM 氟脱氧尿苷（FUDR），10 mL：
0.3693 gFUDR
10 mL无菌去离子水
于 -20 °C 保存。
100 mg/mL 氨苄青霉素（Amp），10 mL：
1 gAmpicillin
10 mL无菌去离子水
于 -20 °C 保存。
50 mg/mL 羧苄青霉素（Carb），10 mL：
500 mgCarbenicillin
10 mL无菌去离子水
于 -20 °C 保存。
1 M 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），10 mL：
2.38 gIPTG
10 mL无菌去离子水
于 -20 °C 保存。

线虫生命周期示意图：从卵到成虫阶段，包括L1-L4幼虫及雄性成虫发育。
图1. C. elegans 各生命阶段的明场图像，包括卵、四个幼虫阶段（L1–L4）和成虫。除右下角为成年雄虫外，其余各图均为雌雄同体（图片来自Wood（1988））。

寿命分析；野生型与daf-2突变型随时间（天）的生存结果表格及图表。
图2. 比较野生型N2品系与daf-2基因突变品系的C. elegans寿命实验代表性结果。（A）数据汇总表，包括自线虫为卵以来的天数、每日观察到的死亡线虫数量，以及每日仍存活个体占原始样本的百分比（根据每日死亡线虫计数计算得出）。（B）与（A）中提供的寿命数据相对应的生存曲线。

C. elegans development stages, microscopy: bright field vs. DAPI fluorescence, Day 4 & 8 comparison.
图3. 年轻与老年成年个体间脂褐素的代表性比较 秀丽隐杆线虫左侧为明场图像，右侧为DAPI荧光通道图像。上方图显示4日龄（自卵起计）线虫，下方图显示11日龄线虫。

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讨论

秀丽隐杆线虫（C. elegans）的寿命遗传调控已被广泛研究，这主要得益于其寿命测定操作简便且周期短。本文所讨论的实验方案为获得可重复的 C. elegans 寿命数据提供了基本框架，也可应用于其他相关线虫物种。2 通过一些简单的调整，这些操作步骤可被改造用于在多种不同条件下测定寿命。本文将介绍几种常见的变体方法，包括使用活细菌、RNA干扰（RNAi）、通过剥夺细菌实现饮食限制，以及无药物的NGM培养基条件。

该实验方案最常见的一个变体是使用活细菌来培养线虫。  这可以通过一些小的调整来实现。首先，改变在平板上接种细菌的步骤（步骤1.7至1.13）：无需将OP50菌液培养至饱和期，而是培养至对数中期，然后直接从液体培养物中吸取200 µL滴加到平板上。让细菌在平板上过夜生长，并省去紫外线照射步骤。同时，在含有FUDR的平板中也应去除氨苄青霉素。使用活细菌的一个优点是，由于细菌食物处于存活并持续生长状态，线虫无需频繁转移至新的平板。然而，活细菌作为食物的缺点在于OP50对秀丽隐杆线虫（C. elegans<...

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致谢

本工作获得了Glenn/AFAR老年病学突破奖和美国国立卫生研究院（NIH）资助项目1R01AG031108-01对M. K.的支持。G. S. 获得了NIH培训资助项目P30AG013280的支持。M. K. 是艾里森医学基金会老年病学新学者。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂试剂Fisher ScientificDF0145-17-0 (214530)
氨苄青霉素试剂MidSci0339
胰蛋白胨试剂Fisher ScientificDF0123-17-3 (211705)
蛋白胨试剂Fisher ScientificDF0118-17-0 (211677)
CaCl2试剂Fisher ScientificNC9699248 (1332-01)
羧苄青霉素试剂Gold BiotechnologyC0109
胆固醇试剂Sigma-AldrichC75209
氟脱氧尿苷（FUDR）试剂Sigma-AldrichF0503
异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）试剂Gold BiotechnologyI2481C5
磷酸氢二钾试剂Fisher Scientific5087862 (3252-01)
磷酸二氢钾试剂Fisher Scientific5087861 (3246-01)
MgSO4试剂Fisher ScientificNC9561800 (2500-01)
NaCl试剂Fisher ScientificS251
Tris试剂Sigma-AldrichT1503
酵母提取物试剂Fisher ScientificDF0886-17-0 (288620)

参考文献

  1. Wood, W. B. The Nematode Caenorhabditis elegans. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-16 (1988).
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