活体成像观察果蝇复眼原基盘中胶质细胞的迁移

摘要

本文介绍了一种利用活体显微分析结合GFP标记的胶质细胞，研究胶质细胞迁移进入发育中黑腹果蝇（Drosophila）眼部的实验方案。

摘要

脊椎动物和无脊椎动物的胶质细胞都必须迁移到最终的目标区域，才能包裹和支持相应的神经元。尽管最近已有研究进展，能够描述胶质细胞在发育中的蛹翅中进行的活体迁移（1），但对Drosophila胶质细胞迁移的研究通常涉及对固定组织的检测。对运动细胞进行活体显微分析能够观察细胞在整个迁移过程中的行为，包括确定其生长速度和方向变化。结合遗传学工具的使用，活体成像可用于更精确地确定特定基因在发育过程中的作用。此前 Silies 等人的研究等(2) 已描述了起源于视柄（连接发育中眼和脑的结构）的胶质细胞向眼成虫盘迁移的过程，该观察基于固定组织。本文中，我们概述了一种检测胶质细胞活体迁移进入眼成虫盘的实验方案Drosophila眼成虫盘。我们利用一种在发育中的胶质细胞中表达GFP的果蝇品系，以追踪野生型及突变型动物中胶质细胞的发育进程。

方案

第1部分：实验前准备。

1. 提前一周交配果蝇，以获得在胶质细胞特异性启动子控制下表达GFP的幼虫。在本实验中，我们利用reversed polarity (repo)启动子在胶质细胞中表达带有核定位序列的GFP进行观察（3, 4）。
2. 至少提前一天准备盖玻片：将18 mm圆形盖玻片浸入1%多聚赖氨酸溶液中10分钟，随后过夜自然晾干。
3. 实验前一天，将Chamlide磁力培养腔的组件浸泡于70%乙醇中过夜，以完成清洗。
4. 实验当天，采用无菌操作技术，将胎牛血清、青霉素-链霉素溶液和胰岛素加入10 ml Schneider昆虫培养基中，配制培养液。终浓度分别为：1X胎牛血清、100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml链霉素和0.2 mg/ml胰岛素（改良自（5））。
5. 在细胞培养超净台中让培养腔自然晾干，随后用配制好的培养液冲洗，以去除残留的乙醇。

第二部分：解剖 果蝇 眼-脑复合体

1. 从果蝇培养管壁上选取一只三龄游走期幼虫，置于冰上培养皿中的一滴预冷培养基液滴内，静置数分钟。建议将幼虫冷却以减缓其肠道蠕动，便于解剖操作。
2. 将冷却后的幼虫转移至涂有Sylgard的培养皿中的一滴培养基液滴内，并置于解剖显微镜下。
3. 在解剖显微镜下，使用一对Dumont精细镊子牢牢夹住幼虫后端约三分之一处。等待幼虫前端完全伸出其口钩。当口钩完全伸展后，用第二对镊子夹住口钩。解剖时，缓慢将两对镊子向相反方向拉动。眼-脑复合体连同唾液腺、脂肪体和成虫盘组织将从幼虫体部分离。切勿过快拉动口钩，否则可能导致口钩与眼-脑复合体分离断裂。
4. 使用超精细剪刀修剪去除唾液腺、脂肪体和成虫盘。此时脑的两个半球及眼盘仍与腹神经索和口钩相连。
5. 将一个18 mm盖玻片放置于载玻片上，使盖玻片一侧边缘悬出载玻片边缘，以便后续用镊子拾取。在18 mm盖玻片上滴加一滴培养基。用镊子夹住口钩，将眼-脑复合体转移至培养基液滴中。切勿直接用镊子夹取眼-脑复合体，以免损伤组织。
6. 使用精细解剖剪刀将眼-脑复合体上的口钩剪除并弃去。去除口钩对于活体成像至关重要，因为口钩在培养基中会持续收缩，导致显微观察时组织移动。
7. 若需观察眼成虫盘内胶质细胞的迁移过程，应小心切断连接脑与眼盘的细长组织——视柄，并将脑组织推离或弃去（见图1A）。若需观察视柄内的胶质细胞，则应保持脑、视柄和眼成虫盘结构完整（见图1E）。
8. 用镊子拾起盖玻片，在盖玻片下方围绕目标组织用永久性记号笔画一个圆圈。该标记将有助于在第四部分的显微观察中快速定位组织。

第3部分：在磁力培养皿中安装眼原基盘。

1. 使用镊子夹住盖玻片悬挂的边缘，将盖玻片转移至Chamlide磁力腔室的底板上，注意不要扰动培养中的组织。
2. 将硅胶O型环放置在Chamlide腔室主体上，再将主体安装在底板上方。
3. 缓慢向腔室内加入培养基。加入速度不宜过快，以免扰动目标组织。不要将腔室完全注满，以便盖子下方留有空间进行气体交换。
4. 轻轻地将透明盖子盖在Chamlide腔室上方。

第4部分：眼盘中迁移胶质细胞的可视化。

1. 将培养室置于共聚焦或荧光显微镜的载物台上。使用盖玻片上的圆圈作为参考，在低倍镜下定位样品。
2. 使用40倍物镜对样品进行聚焦。让组织自然沉降到盖玻片上。在3至4小时内，每隔10至15分钟拍摄一次眼盘或视柄的图像。组织可能会颤动并偏离焦平面。在图像采集前手动重新聚焦可缓解此问题。

第5部分：代表性结果：

正确操作时，本方案使我们能够获得一系列从视神经索迁移至眼成虫盘的GFP标记胶质细胞的图像（图1 B-D）。尽管对wild type eye成虫盘进行60分钟的活体成像已足以观察胶质细胞核位置的变化，但在某一对胶质细胞迁移至关重要的基因发生突变的情况下，胶质细胞核完全无法离开视神经索（箭头所示，图1 F-H）。

我们已将眼-脑复合体培养长达240分钟，之后开始观察到培养组织出现退化现象。在240分钟时间点后，我们开始在培养的眼-脑复合体周围的培养基中观察到GFP阳性细胞（箭头，图2 C）。此外，GFP会在组织内广泛分布的弥散斑点中积聚，提示组织完整性发生破坏。

图1：在发育中的野生型和突变体视觉系统中对GFP标记的胶质细胞核进行活体成像。
A、E）利用微分干涉差（DIC）显微镜拍摄的培养中野生型和突变体眼成虫盘（ED）图像。在野生型中，胶质细胞在视柄（OS）中生成，并迁移至眼成虫盘内。为便于眼成虫盘的展平和成像，已将脑组织去除。B-D）对（A）中培养的野生型眼成虫盘在0、30和60分钟时间点进行荧光显微成像，显示GFP标记的胶质细胞核在眼成虫盘内发生迁移。

F-H) 对 (E) 中突变体眼-脑复合体在 0、30 和 60 分钟时间点进行荧光显微观察，显示GFP标记的胶质细胞核在视神经 stalk 中停滞（箭头所示）。为便于对 stalk 内胶质细胞成像，脑组织（BR）保留在视神经 stalk 上。

图2：在野生型眼成虫盘中对GFP标记的胶质细胞膜进行活体成像。我们已成功将眼-脑复合体培养长达240分钟。超过240分钟的组织培养开始出现降解。在0分钟（A）和150分钟（B）时，围绕眼成虫盘（ED）、视柄（OS）和脑叶（BR）的培养基中无GFP阳性细胞，而300分钟时间点（C）则可见GFP阳性细胞，箭头所示。

讨论

在本实验方案中，我们描述了利用活体显微镜观察胶质细胞迁移进入眼成虫盘的过程。在我们的wild type示例（图1 A-D）中，使用了核定位的GFP标记物，以观察眼成虫盘中胶质细胞在一小时内的运动情况。在我们实验室目前研究的一个与胶质细胞迁移相关的候选基因突变体中，我们观察到胶质细胞核在一小时内停滞于视神经束内（图1 E-H）。我们的策略可被进一步调整，以可视化由目标基因调控的细胞行为的更多细节。例如，可在胶质细胞中表达膜定位的GFP分子（如mCD8-GFP），以观察细胞突起结构。使用膜结合型GFP标记物将使我们能够判断突变体中的胶质细胞是否能够向眼成虫盘内延伸诸如丝状伪足等细胞突起。同样，也可在发育中的胶质细胞中表达GFP标记的肌动蛋白（GFP-actin）或GFP标记的微管蛋白（GFP-tubulin），以观察胶质细胞迁移过程中细胞骨架的变化。此外，还可通过活体显微镜观察单个GFP标记的突变胶质细胞（6）。该技术将使我们更准确地描述目标基因在调控胶质细胞迁移过程中的必要性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚-L-赖氨酸	试剂	Sigma-Aldrich	P8920
Schneider’s 昆虫培养基	试剂	Sigma-Aldrich	S0146
青霉素-链霉素	试剂	Sigma-Aldrich	P4458
牛胰腺胰岛素溶液	试剂	Sigma-Aldrich	I0516
Chamlide 磁性培养皿	工具	Live cell Instrument	CM-R-10	适用于 18 mm 盖玻片的 35 mm 培养皿型腔室
超精细剪刀	工具	Fine Science Tools	15200-00
Dumont #5 镊子	工具	Fine Science Tools	11251-20
荧光显微镜	显微镜	Carl Zeiss, Inc.		任何具备 GFP 所需滤光片和激发光源的荧光成像系统均可使用。