通过老化细胞的再生长定量酵母时序性寿命

摘要

酵母的时序性衰老是指细胞在静止期随着时间推移而丧失活力的现象。本文介绍一种用于定量测定酵母时序性寿命的高通量方法。

摘要

出芽酵母Saccharomyces cerevisiae在衰老研究领域已被证明是一种重要的模式生物¹. 酵母中的复制寿命和时序寿命是研究酵母衰老的两种公认范式。复制衰老定义为单个酵母母细胞在衰老前产生的子代细胞数量；时序衰老则由细胞在非分裂、类似静止状态下的存活时间长短来定义。²我们开发了一种用于定量测定细胞时序性寿命的高通量方法。该方法包括在特定培养基中，于振荡条件下和恒定温度下对细胞进行老化培养。在每一个时间点，从老化培养物中取出一部分细胞亚群，并接种至富含营养的生长培养基中。随后，使用 Bioscreen C MBR 仪器对该部分老化细胞亚群获得高分辨率的生长曲线。接着应用一种算法，根据每个时间点的生长动力学数据，确定各细胞亚群中活细胞的相对比例。与现有的其他时序性寿命检测方法相比，该方法所需时间和资源显著减少，同时保持了良好的可重复性和精确性。该检测方法的高通量特性将有助于开展大规模的遗传学和化学筛选，以发现新的寿命调控因子，并进一步在更复杂的生物体中进行验证。

方案

第1部分：衰老培养物的制备

1. 从冻存菌种中挑取目标菌株，在YEPD琼脂平板（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%琼脂、2%葡萄糖）上划线接种。
2. 将平板在30 °C下培养48小时，或直至单菌落出现。
3. 挑取单菌落，接种于试管中含5 mL YEPD液体培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）中。
4. 在30 °C下振荡或使用滚筒摇床持续振荡培养过夜。
5. 取50 µL过夜培养物接种至5 mL合成完全（SC）培养基（表1）中。通常每种菌株制备三份SC培养物，以实现每种被测菌株寿命分析的三个生物学重复。
6. 在整个实验过程中（通常为2周或更长时间），将培养物置于30 °C并在滚筒摇床上持续振荡培养。

第二部分：采集存活率年龄点

在SC培养基中培养两天后，细胞应进入静止期，此时可采集第一个年龄时间点。此后，应每隔2-3天采集一次样本，持续至少两周。每个年龄时间点的采集步骤如下：

1. 通过向每个孔中加入 145 µL YEPD，准备 Bioscreen 100 孔 Honeycomb 板以进行接种。务必至少留出一个孔仅含有 YEPD 而无细胞，用于后续数据分析。
2. 从培养箱中取出老化培养物。
3. 对第一个将要接种到 Honeycomb 板中的培养物进行短暂....

讨论

本文所述的高通量时序性寿命测定法是一种高效、准确且精确量化大量菌株衰老潜能的方法。与通过计数菌落形成单位来确定存活率的经典方法（例如参见³）相比，该方法的主要进步在于采用摇床/培养箱/酶标仪联用设备（如Bioscreen C MBR仪器），在每个年龄时间点获取高分辨率的生长曲线。与低通量时序性寿命测定法直接比较表明，该方法可达到相当甚至更高的精确度，同时显著增加可分析样本的数量⁴。

上述方法适用于在衰老研究常用的培养条件下，筛选影响时间性寿命的遗传变异。然而，该方法也可轻松地适用于其他培养条件，例如预先适应呼吸性生长（甘油作为碳源）⁵、将细胞维持在水中而非耗尽的培养基中，或进行饮食限制相关研究⁴。此外，也可将其调整用于药物筛选，例如向衰老培养基中添加来自化合物库的不同化学物质，而非接种不同菌株。

本文所述方法在用于寿命测定的年龄时间点选择上也具有灵活性。如上所述，实验中的年龄时间点分别取在第2、4、6、9、11和13天。这些时间点适用于筛选.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰蛋白胨	试剂	BD Biosciences	211677
酵母提取物	试剂	BD Biosciences	288620
琼脂粉	试剂	BD Biosciences	214530
无氨基酸和氨基酸盐的酵母氮源基础	试剂	MidSci	J630-500G
氨基酸	试剂	Sigma-Aldrich
硫酸铵	试剂	Spectrum	AM185
葡萄糖	试剂	Fisher Scientific	D16-10
Bioscreen C MBR 仪器	工具	Growth Curves USA	5101370
Bioscreen 100 孔蜂巢板	工具	Growth Curves USA	9502550