酵母的时序性衰老是指细胞在静止期随着时间推移而丧失活力的现象。本文介绍一种用于定量测定酵母时序性寿命的高通量方法。
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本文内容
摘要
摘要
出芽酵母Saccharomyces cerevisiae在衰老研究领域已被证明是一种重要的模式生物1. 酵母中的复制寿命和时序寿命是研究酵母衰老的两种公认范式。复制衰老定义为单个酵母母细胞在衰老前产生的子代细胞数量；时序衰老则由细胞在非分裂、类似静止状态下的存活时间长短来定义。2我们开发了一种用于定量测定细胞时序性寿命的高通量方法。该方法包括在特定培养基中，于振荡条件下和恒定温度下对细胞进行老化培养。在每一个时间点，从老化培养物中取出一部分细胞亚群，并接种至富含营养的生长培养基中。随后，使用 Bioscreen C MBR 仪器对该部分老化细胞亚群获得高分辨率的生长曲线。接着应用一种算法，根据每个时间点的生长动力学数据，确定各细胞亚群中活细胞的相对比例。与现有的其他时序性寿命检测方法相比，该方法所需时间和资源显著减少，同时保持了良好的可重复性和精确性。该检测方法的高通量特性将有助于开展大规模的遗传学和化学筛选，以发现新的寿命调控因子，并进一步在更复杂的生物体中进行验证。
方案
第1部分：衰老培养物的制备
- 从冻存菌种中挑取目标菌株，在YEPD琼脂平板（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%琼脂、2%葡萄糖）上划线接种。
- 将平板在30 °C下培养48小时，或直至单菌落出现。
- 挑取单菌落，接种于试管中含5 mL YEPD液体培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）中。
- 在30 °C下振荡或使用滚筒摇床持续振荡培养过夜。
- 取50 µL过夜培养物接种至5 mL合成完全（SC）培养基（表1）中。通常每种菌株制备三份SC培养物，以实现每种被测菌株寿命分析的三个生物学重复。
- 在整个实验过程中（通常为2周或更长时间），将培养物置于30 °C并在滚筒摇床上持续振荡培养。
第二部分：采集存活率年龄点
在SC培养基中培养两天后，细胞应进入静止期，此时可采集第一个年龄时间点。此后，应每隔2-3天采集一次样本，持续至少两周。每个年龄时间点的采集步骤如下：
- 通过向每个孔中加入 145 µL YEPD，准备 Bioscreen 100 孔 Honeycomb 板以进行接种。务必至少留出一个孔仅含有 YEPD 而无细胞，用于后续数据分析。
- 从培养箱中取出老化培养物。
- 对第一个将要接种到 Honeycomb 板中的培养物进行短暂涡旋振荡，注意避免洒出任何培养液。
- 吸取 5 µL 混合后的培养物，移入 Honeycomb 板的第一个孔中。每次移取 5 µL 前后，均需对每支试管口进行火焰灭菌。
- 对每种老化培养物重复此操作，并准确记录各培养物对应的孔位。在整个实验过程中，每个后续时间点应使用相同的孔位。
- 完成接种后，将培养物放回 30˚C 培养箱中继续培养。
第3部分：装载 Bioscreen C MBR 仪器
- 打开培养箱盖子，暴露培养舱，并取下样品架的盖子。
- 将新接种的Honeycomb板插入样品架中（如果只读取一块板，请使用左侧插槽）。
- 重新盖上样品架盖子，并合上培养箱盖。
- 检查传热液液面是否高于最低填充线。如果液位偏低，使用1000 µL移液器加入提供的传热液进行补充。
- 使用Bioscreen软件“EZExperiment”设置以下参数，以获得适合酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的生长曲线：
- 样品数量：输入含有培养基的孔数或200
- 滤光片：420-580nm，宽带
- 温度：30°C
- 实验时长：1天0小时0秒
- 测量间隔：30分钟
- 振荡：开启，连续振荡，高强度
- 点击“开始”以启动读数。
第4部分：数据分析
通常在两周内选取六个时间点进行检测，分别在第2、4、6、9、11和13天进行。根据实验设计和所测试的菌株不同，可能需要更频繁或更少地采集时间点，或超过两周的时间。每次采集时间点时，必须以相同的顺序加载Honeycomb板，确保每个衰老培养物在每次时间点都对应相同的孔位，这将大大简化数据分析过程。
- 从 Bioscreen C MBR 仪器获取输出文件。软件“EZExperiment”会将 Bioscreen 数据输出为制表符分隔的文件，该文件可与 Microsoft Excel 及其他软件兼容。第一列显示实验过程中测量 OD 值的时间点，后续各列代表 Bioscreen Honeycomb 板中的每个孔（图 1）。
- 删除每列中的第一个 OD 读数。该读数属于“噪声”。
- 通过从每列所有 OD 值中减去仅含 YEPD 的孔的 OD 值来对数据进行归一化处理。此步骤可消除培养基本身的背景吸光度。
- 绘制生长曲线。曲线将随细胞年龄而发生位移（图 2）。例如，将第 1 列（Honeycomb 板中的第 1 孔）在六个时间点的生长曲线绘制在一起，可观察到曲线随时间明显向右移动。
- 根据第 2 天年龄点的生长动力学计算每个孔的倍增时间（δ）。用于计算倍增时间的公式为：
其中 OD1 和 OD2 表示连续两次 OD 测量值，t1 和 t2 为两次测量之间的时间间隔。仅在 OD 值介于 0.2 至 0.5 之间时计算倍增时间。这些值的平均值即为该孔的倍增时间。大多数野生型酵母菌株的倍增时间应在 85 至 90 分钟之间。 - 针对每个年龄点，计算其相对于初始年龄点（第 2 天）的生长曲线时间偏移（∆t）。一种简便方法是计算每个孔从初始年龄点到后续各年龄点达到 OD 0.3 所需时间的差值。特定孔达到 OD 0.3 的时间可通过线性回归方程计算，该方程对应于 OD=0.3 前后两个时间点之间 ln(OD) 随时间变化的关系。
- 计算每个年龄点的存活比例，以生成存活曲线（图 3）。将初始年龄点（第 2 天）定义为 100% 存活率。对于每个后续年龄点，使用以下公式计算存活百分比：
其中 sn 为存活百分比，∆tn 为时间偏移，δn 为倍增时间。 - 通过将每个孔（或重复孔）的存活细胞比例（或百分比）对年龄作图，按需生成存活曲线（图 3B）。
- 计算每个孔的存活积分（SI）。SI 定义为存活曲线下面积，可通过以下公式估算：
其中 agen 为年龄点（例如 2、4、6、9、11 和 13），sn 为该年龄点的存活值。 - 根据 SI 和存活数据确定重复孔的统计参数。常用的统计参数包括每组生物学重复的均值、中位数和方差。可使用 t 检验或类似分析方法对不同实验组与对照组的 SI 进行成对比较。也可根据 4.8 中所述方法，基于平均后的生物学重复数据生成存活曲线。
第5部分：代表性结果
实验结束后，您将绘制出生存曲线，并完成足够的数据分析，以确定多种不同菌株或条件下的时序性衰老潜力。若操作正确，从Bioscreen C MBR仪器获得的生长曲线应与图2所示相似，所得生存曲线应与图3所示相似。通常情况下，在本实验所述条件下培养的野生型细胞，其中位时序寿命约为7天。不同菌株及某些条件下（例如在含0.05%葡萄糖的培养基中生长）的生存情况存在显著差异，其中位生存时间可超过30天。
图1. 来自 Bioscreen 程序“EZExperiment”的数据输出。A 列显示了吸光度读数的测量时间。后续各列代表接种了来自老化培养物细胞的 Honeycomb 板中的孔。
图2. 实验过程中单个生物学重复的生长曲线。随着时间推移，衰老培养物中的细胞活力下降，曲线呈现出明显的偏移。初始时间点（第2天）与后续时间点之间的时间间隔决定了该特定年龄下的细胞活力。
图3. A) 使用图1中的生长出数据生成的生存曲线。第2天的时间点被设定为100%存活力。 B) 在同一实验中测试的两种菌株的最终生存曲线。这些生存曲线代表每种菌株三个生物学重复的平均存活力。误差线表示生物学重复内的标准偏差。生存曲线下方的阴影区域代表菌株1的生存积分（SI）。
| 表1. 用于时序衰老研究的合成限定培养基（菌株背景 BY4743） | |
| 组分 | 浓度 (g/L) |
| D-葡萄糖 | 20 |
| 酵母氮源基础（-AA/AS） | 1.7 |
| (NH4)2SO4 | 5.0 |
| 腺嘌呤 | 0.04 |
| L-精氨酸 | 0.02 |
| L-天冬氨酸 | 0.1 |
| L-谷氨酸 | 0.1 |
| L-组氨酸 | 0.1 |
| L-亮氨酸 | 0.3 |
| L-赖氨酸 | 0.03 |
| L-甲硫氨酸 | 0.02 |
| L-苯丙氨酸 | 0.05 |
| L-丝氨酸 | 0.375 |
| L-苏氨酸 | 0.2 |
| L-色氨酸 | 0.04 |
| L-酪氨酸 | 0.03 |
| L-缬氨酸 | 0.15 |
| 尿嘧啶 | 0.1 |
注意：本配方针对二倍体 BY4743 菌株的营养缺陷型进行设计。氨基酸营养缺陷型应通过向完全合成培养基中添加 5 倍终浓度的相应氨基酸来补偿。
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讨论
本文所述的高通量时序性寿命测定法是一种高效、准确且精确量化大量菌株衰老潜能的方法。与通过计数菌落形成单位来确定存活率的经典方法（例如参见3）相比，该方法的主要进步在于采用摇床/培养箱/酶标仪联用设备（如Bioscreen C MBR仪器），在每个年龄时间点获取高分辨率的生长曲线。与低通量时序性寿命测定法直接比较表明，该方法可达到相当甚至更高的精确度，同时显著增加可分析样本的数量4。
上述方法适用于在衰老研究常用的培养条件下，筛选影响时间性寿命的遗传变异。然而，该方法也可轻松地适用于其他培养条件，例如预先适应呼吸性生长（甘油作为碳源）5、将细胞维持在水中而非耗尽的培养基中，或进行饮食限制相关研究4。此外，也可将其调整用于药物筛选，例如向衰老培养基中添加来自化合物库的不同化学物质，而非接种不同菌株。
本文所述方法在用于寿命测定的年龄时间点选择上也具有灵活性。如上所述，实验中的年龄时间点分别取在第2、4、6、9、11和13天。这些时间点适用于筛选...
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致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目1R21AG031965-01A1支持。M. K. 是艾里森衰老医学基金会新学者。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 胰蛋白胨 | 试剂 | BD Biosciences | 211677 | |
| 酵母提取物 | 试剂 | BD Biosciences | 288620 | |
| 琼脂粉 | 试剂 | BD Biosciences | 214530 | |
| 无氨基酸和氨基酸盐的酵母氮源基础 | 试剂 | MidSci | J630-500G | |
| 氨基酸 | 试剂 | Sigma-Aldrich | ||
| 硫酸铵 | 试剂 | Spectrum | AM185 | |
| 葡萄糖 | 试剂 | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Bioscreen C MBR 仪器 | 工具 | Growth Curves USA | 5101370 | |
| Bioscreen 100 孔蜂巢板 | 工具 | Growth Curves USA | 9502550 |
参考文献
- Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Replicative aging in yeast: the means to the end. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29(2008).
- Kaeberlein, M. Handbook of models for human aging. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109(2006).
- Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2 (2), 73(2003).
- Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (2), 113(2008).
- Piper, P. W., Harris, N. L., MacLean, M. Preadaptation to efficient respiratory maintenance is essential both for maximal longevity and the retention of replicative potential in chronologically ageing yeast. Mech Ageing Dev. 127 (9), 733(2006).
- Fabrizio, P., et al. Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 166 (7), 1055(2004).
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重印与许可
