为进行火炬松（P. taeda）及其他针叶树种的基因表达研究，开发了cDNA微阵列PtGen2。本文展示了使用该微阵列时可采用的杂交前和杂交后处理及洗涤技术，以获得更高的重复性、更少的假象以及更低的背景信号。
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摘要
摘要
PtGen2 是一个包含 26,496 个特征的 cDNA 微阵列，其内容为扩增的湿地松 EST。该微阵列由我们实验室制备，供研究松树及其他针叶树基因表达的研究人员使用。PtGen2 源于我们在湿地松中进行的基因发现工作，主要由来自根组织的序列组成，同时也包含部分来自针叶和茎的序列1,2。PtGen2 已通过多种实验进行验证，包括使用不同 Cy 染料标记的针叶树靶标 cDNA 进行杂交，采用扩增和非扩增的间接标记方法，并测试了多种杂交和洗涤条件。本视频重点介绍杂交前及杂交后玻片的处理与操作流程，其中包含对先前建立的实验步骤所做的若干改进3,4。此外，仅以文本形式提供了靶标 cDNA 的制备、标记与纯化所用的实验方案，以及下游数据处理所用软件的相关信息。
PtGen2 使用一种含有高浓度盐的专有打印缓冲液进行打印，这些盐分可能难以完全去除。在预杂交之前，先将芯片在温热的SDS溶液中清洗。预杂交后，芯片需在多次更换的水中充分洗涤，以彻底清除残留的盐分。随后，清洁并放置LifterSlips™盖片于芯片上，并通过毛细作用小心地将标记的cDNA加载到微阵列上，从而确保样品在芯片表面均匀分布，并降低产生气泡的可能性。靶标与芯片的杂交在48°C、高湿度条件下进行。杂交完成后，在53°C和室温下进行一系列标准的长时间洗涤步骤。采用本技术处理PtGen2芯片，可减少因处理不严格而常出现的盐和SDS相关干扰物。使用来自多种不同针叶树RNA来源的靶标进行杂交时，该处理方案可产生更少的干扰信号、降低背景值，并在不同实验组的芯片之间提供更好的一致性。
方案
（注意：第1至第4节未在视频中演示）
制备Cy标记的目标cDNA
以下是我们在进行微阵列杂交前，从火炬松总RNA进行cDNA合成及间接cDNA标记所采用的实验方案。尽管已进行了若干非 trivial 的修改，但以下方案与Invitrogen SuperScript间接cDNA标记试剂盒随附说明书中的方案基本相似。
第一部分：第一链 cDNA 合成反应
- 使用前将各试剂盒组分充分混匀并短暂离心。
- 按如下方法准备反应体系：
- X µl DEPC-H2O
- X µl 总RNA，每反应20 µg（经Ambion’s Turbo DNase预处理）
- 2 µl 锚定Oligo(dT)20引物（2.5 µg/µl）
- 1 µl 随机六聚体引物
- 总体积 = 18 µl
- 将离心管于70°C孵育5分钟，随后置于冰上1–2分钟。
- 在冰上向每个反应管中加入以下组分：
- 6 µl 5×第一链缓冲液
- 1.5 µl 0.1 M DTT
- 1.5 µl 10 mM dNTP混合物
- 1 µl RNaseOUT（40 U/µl）
- 2 µl SuperScript III RT（400 U/µl）
- 轻轻混匀并短暂离心。于45°C孵育过夜。
- 向每个反应管中加入15 µl 1 M NaOH，并充分混匀。
- 将离心管于70°C孵育10分钟。
- 加入15 µl 1 M HCl，轻轻混匀。
- 加入20 µl 3 M醋酸钠（pH 5.2），轻轻混匀。
第二部分：纯化第一链 cDNA。
- 向cDNA（来自步骤1.9）中加入500µl上样缓冲液，并充分混匀。
- 将SNAP纯化柱（随间接标记试剂盒提供）置于收集管上，并将您的cDNA加样到柱上。
- 在室温下以14,000g离心1分钟；弃去穿流液。
- 将SNAP柱放回同一收集管中，加入500µl洗涤缓冲液。
- 在室温下以14,000g离心1分钟；弃去穿流液。
- 重复步骤2.4和2.5共三次，总共进行三次500µl的洗涤。
- 再在室温下以14,000g离心1秒；弃去穿流液。
- 将SNAP柱转移至一个新的1.5ml离心管上。
- 向SNAP柱中加入50µl预热的DEPC水（50°C），在室温下孵育1分钟。通过在室温下以14,000g离心1分钟洗脱cDNA。
- 重复步骤2.9，使用100µl预热的DEPC水，并用同一个1.5ml离心管收集洗脱液。
- 向步骤2.9和2.10所得的洗脱液中加入20µl 3M乙酸钠（pH 5.2）。
- 向管中加入3µl糖原（20mg/ml），并混匀。
- 加入500µl预冷的100%乙醇，充分混匀后，在–80°C孵育1小时。
- 在4°C下以14,000g离心20分钟。小心移除上清液。
- 加入500µl预冷的70%乙醇，在4°C下以14,000g离心5分钟。小心移除上清液。
- 将样品在空气中干燥5分钟；确保完全去除乙醇。
- 将2X偶联缓冲液在37°C预热5分钟，并用5µl预热的2X偶联缓冲液重悬cDNA样品。
- 将cDNA/偶联缓冲液在50°C加热10分钟，并充分涡旋混匀。确保cDNA沉淀完全重悬于2X偶联缓冲液中。
第3部分：荧光染料标记
配制反应液时，应注意尽量减少染料溶液暴露于光线下。此外，DMSO 具有吸湿性，会从空气中吸收水分，水分会与染料的 NHS 酯发生反应，显著降低偶联反应效率。请将试剂盒中提供的 DMSO 储存在棕色螺旋盖小瓶中，并置于 –20°C 保存；使用前需将小瓶恢复至室温再打开，以防止冷凝水产生。仅可使用本试剂盒提供的 DMSO。
- 打开一管Cy-3或Cy-5染料，直接向染料管中加入75 µl DMSO。
- 取5 µl DMSO/染料溶液加入第2.18步的试管中。
- 充分混匀，并在室温避光条件下孵育1小时。
- 向染料标记的cDNA溶液中加入20 µl 3 M醋酸钠（pH 5.2）。
- 向cDNA溶液中加入500 µl上样缓冲液，涡旋充分混匀。
- 将SNAP柱置于干净的收集管上，然后将cDNA/缓冲液溶液上样至柱中。
- 在室温下以14,000g离心1分钟，弃去穿流液。
- 将SNAP柱放回同一收集管中，向柱中加入500 µl洗涤缓冲液。
- 在室温下以14,000g离心1分钟，弃去穿流液。
- 重复步骤3.8–3.9三次，共进行三次500 µl洗涤。
- 再于室温下以14,000g离心1分钟，弃去穿流液。
- 将SNAP柱转移至新的棕色收集管上。
- 向SNAP柱中加入65 µl预热的DEPC水（50°C），室温孵育1分钟。
- 在室温下以14,000g离心1分钟，收集穿流液。穿流液应含有60 µl纯化的染料标记cDNA。
第4部分：评估标记程序。
- 采用分光光度计检测法评估每个 Cy-cDNA 标记效果。计算合成 cDNA 的总 pmol 数：[OD260 × 体积 × 37 ng/μl × 103 ng/pg]/324.5 pg/pmol。计算每个标记反应中掺入的 Cy 染料总 pmol 数：pmol Cy3 = [OD550 × 体积]/0.15；pmol Cy5 = [OD650 × 体积]/0.25。接着，计算每个反应的核苷酸/pmole 染料比值。理想的反应应生成 >6000 pmol cDNA（每 60 μl）、>200 pmol Cy 染料（每 60 μl），且核苷酸/染料比值 <30。
第5部分：载玻片预清洗
- PtGen2 芯片打印在 Corning UltraGaps 载玻片（氨基硅烷涂层）上，cDNA 通过紫外线交联固定。由于缓冲液中盐浓度较高，打印点清晰可见。
- 使用金刚石笔在载玻片上标记打印区域的上部和下部位置（可选步骤）。
- 将约 250 mL 预热至 43°C 的 0.2% SDS 溶液加入显微镜载玻片清洗皿（3” × 4”）中。
- 将待预杂交的载玻片放入载玻片架中，迅速浸入 SDS 溶液并剧烈上下移动 15–20 次，以彻底去除载玻片上的盐分。
- 用镊子小心将载玻片从架中取出，放入盛有预杂交缓冲液（5X SSC、0.1% SDS、1% BSA）的 Coplin 染色缸中，缓冲液需预先加热至 43°C。在 43°C 下孵育至少 1 小时。
第6部分：预杂交
- 准备五个载玻片清洗皿，每个皿中装入超纯水（millipure dH2O），另准备一个 Coplin 染色缸，装入分子级异丙醇。将载玻片放入载玻片架中，依次浸入五个清洗皿中，每皿浸洗 20 次。
- 从第五个水洗皿中每次取出两张载玻片，在异丙醇中浸入 5–6 次，立即放入离心机（Chipmate 台式离心机，2 位）的载玻片离心管中，离心 1 分钟以干燥。
- 用经 0.22 μm 滤芯过滤的压缩空气清洁载玻片，并将载玻片条形码面朝上放入 Genomic Solutions 杂交室中。
- 用过滤空气清洁 LifterSlips™，并将它们放置在载玻片上，白色条带朝下。使用黄色移液器吸头轻轻将 LifterSlip 与载玻片对齐（可选：先用 70% 乙醇清洗 LifterSlips™。我们发现此步骤并非必需。）
第7部分：杂交
应在黑暗或弱光条件下进行。
- 对于每张待杂交的芯片，计算所需Cy-5和Cy-3标记的cDNA量，使每种靶标量达到50–75 pmol。将上述两种cDNA混合至同一离心管中，并在真空干燥器中37–45°C加热条件下干燥。注意：避免完全干燥！
- 将干燥后的探针重悬于60 µL当天新鲜配制的杂交缓冲液中，短暂涡旋混匀。
- 将重悬的cDNA在95°C水浴中孵育5分钟，随后短暂离心30秒。
- 通过缓慢地将全部重悬探针液体加样至芯片底部（条形码端）的芯片与LifterSlip™交界处，使液体依靠毛细作用吸入芯片。部分操作者倾向于先将探针滴加在芯片表面，再轻轻覆盖LifterSlip™；此方法仅有一次操作机会，因为一旦产生气泡，放置后不可移动LifterSlip™，否则可能导致点样拖尾等假象。
- 在杂交盒两端的加湿孔中各加入20 µL 100 mM DTT。
- 盖上杂交盒盖子并拧紧卡扣螺丝，用铝箔包裹整个杂交盒，随后置于48°C水浴中，以50–60 rpm轻柔振荡孵育12–18小时。
第8部分：杂交后洗涤
所有洗涤步骤均应在避光或弱光条件下进行。在最终步骤之前，切勿让载玻片干燥。
- 准备一个盛有 53°C 洗涤液 #1 的 Coplin 染色缸，以及四个载玻片清洗皿，每个清洗皿中分别装有 250mL 的以下溶液：1）53°C 洗涤液 #1，2）室温洗涤液 #2，3 和 4）两个盛有室温洗涤液 #3 的清洗皿。
- 小心地将载玻片从杂交腔室中取出，每次两片放入 Coplin 染色缸中。静置 30 秒后缓慢提起载玻片，LifterSlip 将留在染色缸内。将载玻片放入载玻片架中，并立即浸入洗涤液 #1（1X SSC，0.2% SDS，预热至 43°C）中。重复此操作，直至所有 LifterSlips 均被移除，且所有待清洗的载玻片均已放入洗涤液 #1 清洗皿中。剧烈上下浸没载玻片架 10 次。
- 将清洗皿置于 53°C 空气摇床中，以 50–100 rpm 振荡 10 分钟。
- 将载玻片架转移至洗涤液 #2（0.1X SSC，0.2% SDS）中，上下浸没 10 次，随后在室温下缓慢振荡孵育 10 分钟。
- 将载玻片架在第一个洗涤液 #3（0.1X SSC）中浸洗 15 次，以去除来自洗涤液 #2 的任何残留 SDS。然后将载玻片架放入第二个洗涤液 #3 清洗皿中，上下浸没 10 次，再缓慢振荡 10 分钟。
- 将载玻片放入 50mL Falcon 带盖离心管中，在配备摆动桶转子的离心机中以 1,500 rpm 离心。将载玻片转移至避光容器中（我们使用另一支用铝箔包裹的 Falcon 管），用氮气吹洗管内空气，然后紧密盖上管盖（此举可减少 Cy 染料的氧化，尤其是在臭氧浓度最高的夏季）。载玻片可在充氮管中存放数小时后再进行扫描；但最佳信号结果是在洗涤后立即扫描获得。
第9部分：数据收集与统计分析
- 使用 PerkinElmer ScanArray 收集扫描图像数据。我们采用 10 微米的扫描设置，并根据制造商的说明，通过线性调整方法平衡 Cy3 和 Cy5 信号。
- 使用 ImaGene 版本 7.5（BioDiscovery, Inc., El Segundo, CA）对 TIF 文件进行网格化处理，并收集和过滤原始信号数据。
- 使用 BRB Array Tools 版本 3.7 进行数据标准化和评估，以确定具有统计学意义的差异表达物种。
- 使用基因表达模式分析软件（GEPAS）版本 3.1 进行模式分析，以辅助确定协同表达的基因。
图1. 使用本实验方案处理的 PtGen2 芯片示例l.
图2. 使用标准杂交和洗涤流程处理的 PtGen2 芯片示例。
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讨论
PtGen2 是一种近期开发的定制 cDNA 微阵列，主要设计用于火炬松研究领域。迄今为止获得的初步结果表明，该微阵列在评估响应干旱胁迫所发生的转录事件，以及监测海岸松（Pinus pinaster）胚胎发育过程中发生的变化方面，是一种有价值的工具5,6。我们最近还证明，PtGen2 在跨物种杂交中表现良好，可使用从多种不同的松科属中分离的目标样本进行检测5。随着越来越多研究 Pinus 及其他针叶树物种基因表达的科研人员开始使用 PtGen2，本培训视频将为他们提供生成高质量且可重复数据所需的技术基础。据我们经验，与通常用于微阵列实验的条件相比，采用更严格的杂交和洗涤流程处理 PtGen2 时，结果更佳。虽然其他处理 PtGen2 微阵列的方法也曾取得成功，但缺乏一致性。遵循本文所述的技术步骤，将有助于提高实验一致性，尤其是在处理大量微阵列时，并可显著减少或消除不必要的假象和高背景信号。
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致谢
本文中的标记、杂交和洗涤方案对先前由约翰·奎肯布什博士（Dr. J. Quackenbush）在基因组研究所（TIGR）期间、肖恩·利维博士（Dr. Shawn Levy）在范德堡微阵列共享资源中心（VMSR）期间，以及罗布·阿尔巴博士（Dr. Rob Alba）在康奈尔大学博伊斯·汤普森研究所（BTI）期间所开发的方案进行了一些修改。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 预杂交缓冲液 | 缓冲液 | 5X SSC，0.1% SDS，1% BSA | ||
| 杂交缓冲液 | 缓冲液 | 30% 甲酰胺，5X SSC，5X Denhardt’s，1% PolyA RNA（Invitrogen，POLYA.GF），0.1% SDS | ||
| 洗涤液 #1 | 缓冲液 | 1X SSC，0.2% SDS，预热至43℃°C | ||
| 洗液 #2 | 缓冲液 | 0.1X SSC，0.2% SDS | ||
| 洗涤液 #3 | 缓冲液 | 0.1X SSC | ||
| 异丙醇 | 试剂 | Sigma-Aldrich | 34959-2.5L | |
| 50 mL 圆锥形离心管 | 其他 | Falcon BD | 352070 | |
| 15 mL 圆锥形离心管 | 其他 | Falcon BD | 352196 | 在离心过程中，使用此盖或类似的盖子置于每个50 mL圆锥形离心管底部 |
| 考普林染色缸 | Wheaton | 900520 | ||
| 染色皿 &和支架 | 其他 | Wheaton | 900200 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | 其他 | Sigma-Aldrich | A-9418 | |
| PolyA RNA | Invitrogen | POLYA.GF | ||
| SuperScriptTM 间接 cDNA 标记 | 试剂盒 | Invitrogen | L1014-02 | |
| Turbo DNase | 试剂盒 | Ambion | AM1907 | |
| 系统 | ||||
| Cy-5 染料 | 试剂 | GE Healthcare | PA25001 | |
| Cy-3 染料 | 试剂 | GE Healthcare | PA23001 | |
| LifterSlips™ | 其他 | Erie Scientific | 25X601 | |
| HybChambers | 仪器设备 | 基因机器 | JHYB200003 |
参考文献
- Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries. Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).
- Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. unpublished data. , Forthcoming.
- Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques. 29, 548-562 (2000).
- Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development. The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).
- Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray. IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. August 25-29, Quebec City, Quebec, , (2008).
- Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development. 7th Plant Genomics European Meeting. September 24-27, Albena, Bulgaria, , (2008).
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