为进行火炬松（P. taeda）及其他针叶树种的基因表达研究，开发了cDNA微阵列PtGen2。本文展示了使用该微阵列时可采用的杂交前和杂交后处理及洗涤技术，以获得更高的重复性、更少的假象以及更低的背景信号。
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摘要
摘要
PtGen2 是一个包含 26,496 个特征的 cDNA 微阵列，其内容为扩增的湿地松 EST。该微阵列由我们实验室制备，供研究松树及其他针叶树基因表达的研究人员使用。PtGen2 源于我们在湿地松中进行的基因发现工作，主要由来自根组织的序列组成，同时也包含部分来自针叶和茎的序列1,2。PtGen2 已通过多种实验进行验证，包括使用不同 Cy 染料标记的针叶树靶标 cDNA 进行杂交，采用扩增和非扩增的间接标记方法，并测试了多种杂交和洗涤条件。本视频重点介绍杂交前及杂交后玻片的处理与操作流程，其中包含对先前建立的实验步骤所做的若干改进3,4。此外，仅以文本形式提供了靶标 cDNA 的制备、标记与纯化所用的实验方案，以及下游数据处理所用软件的相关信息。
PtGen2 使用一种含有高浓度盐的专有打印缓冲液进行打印，这些盐分可能难以完全去除。在预杂交之前，先将芯片在温热的SDS溶液中清洗。预杂交后，芯片需在多次更换的水中充分洗涤，以彻底清除残留的盐分。随后，清洁并放置LifterSlips™盖片于芯片上，并通过毛细作用小心地将标记的cDNA加载到微阵列上，从而确保样品在芯片表面均匀分布，并降低产生气泡的可能性。靶标与芯片的杂交在48°C、高湿度条件下进行。杂交完成后，在53°C和室温下进行一系列标准的长时间洗涤步骤。采用本技术处理PtGen2芯片，可减少因处理不严格而常出现的盐和SDS相关干扰物。使用来自多种不同针叶树RNA来源的靶标进行杂交时，该处理方案可产生更少的干扰信号、降低背景值，并在不同实验组的芯片之间提供更好的一致性。
方案
（注意：第1至第4节未在视频中演示）
制备Cy标记的目标cDNA
以下是我们在进行微阵列杂交前，从火炬松总RNA进行cDNA合成及间接cDNA标记所采用的实验方案。尽管已进行了若干非 trivial 的修改，但以下方案与Invitrogen SuperScript间接cDNA标记试剂盒随附说明书中的方案基本相似。
第一部分：第一链 cDNA 合成反应
- 使用前将各试剂盒组分充分混匀并短暂离心。
- 按如下方法准备反应体系：
- X µl DEPC-H2O
- X µl 总RNA，每反应20 µg（经Ambion’s Turbo DNase预处理）
- 2 µl 锚定Oligo(dT)20引物（2.5 µg/µl）
- 1 µl 随机六聚体引物
- 总体积 = 18 µl
- 将离心管于70°C孵育5分钟，随后置于冰上1–2分钟。
- 在冰上向每个反应管中加入以下组分：
- 6 µl 5×第一链缓冲液
- 1.5 µl 0.1 M DTT....
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讨论
PtGen2 是一种近期开发的定制 cDNA 微阵列，主要设计用于火炬松研究领域。迄今为止获得的初步结果表明，该微阵列在评估响应干旱胁迫所发生的转录事件，以及监测海岸松（Pinus pinaster）胚胎发育过程中发生的变化方面，是一种有价值的工具5,6。我们最近还证明，PtGen2 在跨物种杂交中表现良好，可使用从多种不同的松科属中分离的目标样本进行检测5。随着越来越多研究 Pinus 及其他针叶树物种基因表达的科研人员开始使用 PtGen2，本培训视频将为他们提供生成高质量且可重复数据所需的技术基础。据我们经验，与通常用于微阵列实验的条件相比，采用更严格的杂交和洗涤流程处理 PtGen2 时，结果更佳。虽然其他处理 PtGen2 微阵列的方法也曾取得成功，但缺乏一致性。遵循本文所述的技术步骤，将有助于提高实验一致性，尤其是在处理大量微阵列时，并可显著减少或消除不必要的假象和高背景信号。
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致谢
本文中的标记、杂交和洗涤方案对先前由约翰·奎肯布什博士（Dr. J. Quackenbush）在基因组研究所（TIGR）期间、肖恩·利维博士（Dr. Shawn Levy）在范德堡微阵列共享资源中心（VMSR）期间，以及罗布·阿尔巴博士（Dr. Rob Alba）在康奈尔大学博伊斯·汤普森研究所（BTI）期间所开发的方案进行了一些修改。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 预杂交缓冲液 | 缓冲液 | 5X SSC，0.1% SDS，1% BSA | ||
| 杂交缓冲液 | 缓冲液 | 30% 甲酰胺，5X SSC，5X Denhardt’s，1% PolyA RNA（Invitrogen，POLYA.GF），0.1% SDS | ||
| 洗涤液 #1 | 缓冲液 | 1X SSC，0.2% SDS，预热至43℃°C | ||
| 洗液 #2 | 缓冲液 | 0.1X SSC，0.2% SDS | ||
| 洗涤液 #3 | 缓冲液 | 0.1X SSC | ||
| 异丙醇 | 试剂 | Sigma-Aldrich | 34959-2.5L | |
| 50 mL 圆锥形离心管 | 其他 | Falcon BD | 352070 | |
| 15 mL 圆锥形离心管 | 其他 | Falcon BD | 352196 | 在离心过程中，使用此盖或类似的盖子置于每个50 mL圆锥形离心管底部 |
| 考普林染色缸 | Wheaton | 900520 | ||
| 染色皿 &和支架 | 其他 | Wheaton | 900200 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | 其他 | Sigma-Aldrich | A-9418 | |
| PolyA RNA | Invitrogen | POLYA.GF | ||
| SuperScriptTM 间接 cDNA 标记 | 试剂盒 | Invitrogen | L1014-02 | |
| Turbo DNase | 试剂盒 | Ambion | AM1907 | |
| 系统 | ||||
| Cy-5 染料 | 试剂 | GE Healthcare | PA25001 | |
| Cy-3 染料 | 试剂 | GE Healthcare | PA23001 | |
| LifterSlips™ | 其他 | Erie Scientific | 25X601 | |
| HybChambers | 仪器设备 | 基因机器 | JHYB200003 |
参考文献
- Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries. Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).
- Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. unpublished data. , Forthcoming.
- Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dhar....
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